Митохондриальные изменения играют важную роль в раке яичников человека. Этот протокол создает эффективную платформу для изоляции и очищения митохондрий от рака яичников человека и контрольных тканей для крупномасштабного протеомического анализа. Митохондрии, как центры энергетического метаболизма, клеточной сигнализации и окислительного стресса, понимание митохондриальных изменений протеома при раке яичников приносят пользу нашему пониманию молекулярного механизма, и является открытием эффективных биомаркеров и терапевтических целей.
Этот метод использует центрифугирование дифференциальной скорости в сочетании с градиентной центрифугой плотности для отделить митохондрии от рака яичников человека в контрольных тканях, что приводит к высокому качеству образцов митохондрий для количественного анализа протеомии. Препарат митохондрий, в сочетании с количественной протеомией иТРАЗ, был успешно использован в анализе тканей рака яичников человека, что легко переводится для анализа других тканей, митохондрий протеомии. Те, кто никогда не выполнял этот метод может обнаружить, что это может быть трудно изолировать митохондрии от контроля яичников, чем раковые ткани.
Необходимо добавить трипсин, чтобы улучшить однородность контрольной ткани и добавить дополнительный слой градиентной среды плотности для улучшения разделения митохондрий. Для начала этой процедуры подготовьте 250 миллилитров буфера митохондриальной изоляции, как указано в текстовом протоколе. Поместите примерно 1,5 грамма тканей рака яичников в чистую стеклянную тарелку.
Добавьте два миллилитров предварительно охлажденного буфера митохондриальной изоляции, чтобы слегка вымыть кровь с поверхности ткани. Повторите эту стирку три раза. Затем используйте чистые офтальмологические ножницы, чтобы полностью измельчить ткань на кусочки, которые составляют примерно один кубический миллиметр, и передать рубленые ткани в 50 миллилитровую центрифугу.
Добавьте 13,5 миллилитров буфера митохондриальной изоляции, содержащего нагарс при концентрации 0,2 миллиграмма на миллилитр. Используйте электронный гомогенизатор для гомогенизации рубленых тканей в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. После этого добавьте еще три миллилитров буфера митохондриальной изоляции в гомогенаты тканей и хорошо перемешайте их с помощью пипетки.
Центрифуга подготовленной ткани гомогената на 1, 300 xg, и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите гранулы и сохранить супернатант. Далее центрифуга супернатант на 10 000 xg и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
Удалите микросодержащую супернатант и держите гранулы. Добавьте 2 миллилитров буфера митохондриальной изоляции и повторно приостановите гранулы тщательно путем легкой трубы. Центрифуга этой гранулы подвески на 7000 кг и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Откажитесь от супернатанта и держите гранулы, которые содержат сырую митохондрию. Добавьте 12 миллилитров градиента плотности 25% для повторной приостановки извлеченных сырых митохондрий. Сделайте градиент прерывистой плотности, содержащий повторно приостановленные сырые митохондрии, как указано в текстовом протоколе, и центрифуга его на 52 000 xg, и при четырех градусах Цельсия в течение 90 минут.
Используйте длинный и тупой шприц для сбора очищенных митохондрий на стыке между 25%и 30% градиентных сред, и передать это в чистую трубку. Добавьте буфер митохондриальной изоляции в собранные митохондрии, чтобы разбавить его до трехкратного объема. Центрифуга при 15 000 xg, и при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.
Откажитесь от супернатанта и держите гранулы. Соберите окончательную гранулу, которая содержит очищенные митохондрии, и хранить его при 20 градусах по Цельсию. Во-первых, подготовить 250 миллилитров буфера митохондриальной изоляции, как указано в текстовом протоколе.
Добавьте примерно 1,5 грамма нормальных контрольных тканей яичников в чистую стеклянную тарелку. Добавьте два миллилитров предварительно охлажденного буфера митохондриальной изоляции, чтобы слегка вымыть кровь с поверхности ткани. Повторите эту стирку три раза.
Используя чистые офтальмологические ножницы, полностью измельчите ткань на кусочки, которые составляют примерно 1 кубический миллиметр, и перенесите рубленые ткани в чистую 50 миллилитровую трубку. Добавьте восемь миллилитров раствора, содержащего 0,05% трипсина и 20 миллимолярной ЭДТА и PBS в рубленые ткани управления, и усваивается при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы помочь лизировать клетки и освободить митохондрии. Центрифуга при 200 xg в течение пяти минут.
Откажитесь от супернатанта и держите ткани и клетки. Добавьте 13,5 миллилитров буфера митохондриальной изоляции, содержащего нагарзу с концентрацией 0,2 миллиграмма на миллилитр, и используйте электрический гомогенизатор для гомогенизации рубленых тканей при четырех градусах Цельсия в течение двух минут. Добавьте еще три миллилитров буфера митохондриальной изоляции в однородные ткани и тщательно перемешайте с помощью пипетки.
Центрифуга подготовленной ткани гомогената на 1, 300 xg и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите гранулы и сохранить супернатант. Центрифуга супернатанта при 10 000 xg и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
Удалите супернатант, который содержит микросомы, и держите гранулы. Затем добавьте 2 миллилитров буфера митохондриальной изоляции и повторно приостановите гранулы тщательно путем легкой трубы. Центрифуга этой гранулы подвески на 7000 кг и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Откажитесь от супернатанта и держите гранулы, которые содержат сырые митохондрии. Добавьте 12 миллилитров градиента плотности 25% для повторной приостановки извлеченных сырых митохондрий. Сделайте градиент прерывистой плотности, содержащий сырые митохондрии, как указано в текстовом протоколе, и центрифуга его на 52 000 xg и при четырех градусах Цельсия в течение 90 минут.
Используйте длинный и тупой шприц для сбора очищенных митохондрий в диапазоне от интерфейса между 25 и 30%gradient среды интерфейс между 34 и 38%градиент сред. Перенесите очищенные митохондрии в чистую трубку. Добавьте буфер митохондриальной изоляции в собранные митохондрии, чтобы разбавить его до трехкратного объема.
Центрифуга при 15 000 xg и при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут, и отбросить супернатант. Добавьте 2 миллилитров буфера митохондриальной изоляции, чтобы повторно приостановить гранулы и центрифугу при 15 000 кг и при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Откажитесь от супернатанта и держите гранулы.
Соберите окончательную гранулу и храните ее при 20 градусах по Цельсию. В этом исследовании, высокое качество митохондриальных образцов готовятся из рака яичников человека и контроля тканей для крупномасштабных количественных протеомии. Есть несколько различий в подготовке митохондрий из тканей рака яичников и контроля тканей яичников, в том числе с использованием различных прерывистой плотности градиента.
После центрифугации, очищенные митохондрии из тканей рака яичников находятся на стыке между 25%и 30%, в то время как те из контрольной ткани яичников находятся в диапазоне от интерфейса между 25%и 30% до интерфейса между 34%и 38%Качество подготовленных митохондрий затем оценивается с дифференциальной скоростью центрифугации и плотности градуграммы с помощью электронной микроскопии. Изображения электронного микроскопа показывают, что как в раке яичников, так и в контроле тканей яичников, основные органеллы изолированы митохондриями, за исключением небольшого количества пероксисом. Тем не менее, морфология митохондрий, как видно, изменить больше в рак яичников, чем контроль ткани яичников.
Качество подготовленных митохондрий также оценивается с помощью западной помарки. Западные изображения помарки также показывают что главным компонентом в подготовленных митохондриальных образцах от рака яичников и завязей управления митохондрии, за исключением небольшого количества peroxisomes, который согласуется с анализом микроскопии электрона. При пероксисомах разумно содержаться в подготовленных митохондриях, так как митохондрии активно взаимодействуют с пероксисомами, что, в свою очередь, отражает функциональную полноту митохондрий.
Эти результаты свидетельствуют о высоком качестве подготовленных митохондриальных образцов. Когда я выполняю эту процедуру, очень важно, чтобы вы полностью фарш тканей до гомогенизации, и добавить трипсин в фарш ткани управления. Важно также, что вы делаете и или подготовлены прерывистой плотности градиента для образцов рака и контроля.
После этой процедуры, iTRA или TMT количественные протеомики или фосфопротеомики могут быть выполнены для уточнения рака яичников митохондрии протеом профиля, и фосфопротеом профиль может быть создан для уточнения роли митохондрий в рак яичников на больших глубинах. Этот метод проложить путь для исследователей систематически изучать митохондрии протеом и фосфопротеом при раке яичников, построить сигнальный путь сетевой системы, и обнаружить надежные биомаркеры и терапевтических целей.
