Mitokondriyal değişiklikler insan yumurtalık kanserlerinde önemli rol oynamaktadır. Bu protokol, mitokondriyi insan yumurtalık kanserinden ve büyük ölçekli proteomik analiziçin kontrol dokularından izole etmek ve arındırmak için etkili bir platform oluşturmakta. Mitokondri, enerji metabolizması, hücre sinyalizasyonu ve oksidatif stres merkezleri olarak, yumurtalık kanserlerinde mitokondriyal proteom değişiklikleri içine anlayış moleküler mekanizma anlayışımıza yarar, ve etkili biyobelirteçleri ve terapötik hedeflerin bir keşif.
Bu teknik, kontrol dokularında insan yumurtalık kanserinden mitokondriyi ayırmak için yoğunluk gradyan santrifüj üvedisantrasyon ile birlikte diferansiyel hız santrifüjü kullanır ve bu da kantitatif proteomik analiz için yüksek kaliteli mitokondri örnekleri ile sonuçlanır. Mitokondri hazırlık, iTRAQ kantitatif proteomik ile birleştiğinde, başarıyla insan yumurtalık kanseri dokusunun analizinde kullanılmıştır, hangi kolayca diğer doku analiz çevirir, mitokondri proteomik. Bu yöntemi hiç gerçekleştirmemiş olanlar kanser dokuları daha yumurtalık kontrolünden mitokondri izole etmek zor olabilir bulabilirsiniz.
Bu kontrol doku homojenizasyon geliştirmek için bir tripsin eklemek ve mitokondri ayrılmasını artırmak için yoğunluk gradyan orta ekstra bir tabaka eklemek gerekir. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi mitokondriyal izolasyon arabelleği 250 mililitre hazırlayın. Temiz bir cam çanak içinde yumurtalık kanseri dokularının yaklaşık 1,5 gram yerleştirin.
Hafifçe doku yüzeyinden kan yıkamak için önceden soğutulmuş mitokondriyal izolasyon tampon iki mililitre ekleyin. Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. Daha sonra, yaklaşık bir milimetre olan parçalar halinde tam doku kıyma için temiz oftalmik makas kullanın ve 50 mililitrelik bir santrifüj tüp içine kıyılmış dokuları aktarın.
Mililitre başına 0,2 miligram konsantrasyonda nagarse içeren 13,5 mililitre mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin. Dört santigrat derece iki dakika için kıyılmış dokuları homojenize etmek için elektronik bir homojener kullanın. Bundan sonra, doku homojenates mitokondriyal izolasyon tampon başka üç mililitre ekleyin ve pipetting tarafından iyice karıştırın.
Hazırlanan dokuyu 1, 300 xg ve 4 santigrat derecede 10 dakika homojen olarak santrifüj edin. Pelet çıkarın ve supernatant tutun. Sonra, 10, 000 xg ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat supernatant santrifüj.
Mikrozom içeren süpernatant'ı çıkarın ve peleti saklayın. Mitokondriyal izolasyon tampon 2 mililitre ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice pelet yeniden askıya. Santrifüj bu pelet süspansiyon 7, 000 xg ve dört derece santigrat 10 dakika.
Supernatant atın ve ham mitokondri içeren pelet, tutmak. Çıkarılan ham mitokondriyi yeniden askıya almak için %25 yoğunlukgradient ortamının 12 mililitresini ekleyin. Metin protokolünde belirtildiği gibi yeniden askıya alınmış ham mitokondriyi içeren bir kesintili yoğunluk gradyanı yapın ve 52, 000 xg ve 4 santigrat derecede 90 dakika santrifüj edin.
%25 ve %30 degrade ortamlar arasındaki arabirimde saflaştırılmış mitokondriyi toplamak için uzun ve künt bir şırınga kullanın ve bunu temiz bir tüpe aktarın. Toplanan mitokondriye mitokondriye mitokondri izolasyon tamponu ekleyerek üç kat hacimde seyreltin. Santrifüj 15, 000 xg ve 4 santigrat derecede 20 dakika.
Supernatant atın ve pelet tutun. Saflaştırılmış mitokondri içeren son pelet toplamak ve 20 santigrat derece saklayın. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi mitokondriyal izolasyon tampon250 mililitre hazırlayın.
Temiz bir cam çanağa normal kontrol yumurtalık dokularının yaklaşık 1,5 gram ekleyin. Hafifçe doku yüzeyinden kan yıkamak için önceden soğutulmuş mitokondriyal izolasyon tampon iki mililitre ekleyin. Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın.
Temiz oftalmik makas kullanarak, tamamen yaklaşık 1 milimetre lik parçalar halinde doku kıyma ve temiz bir 50 mililitrelik tüp içine kıyılmış dokuları aktarın. Kıymalı kontrol dokularına %0.05 tripsin ve 20 milimolar EDTA ve PBS içeren bir çözeltinin sekiz mililitresini ekleyin ve hücreleri kontrol etmek ve mitokondriyi serbest bırakmak için oda sıcaklığında 30 dakika sindirin. Santrifüj 200 xg beş dakika.
Supernatant atın ve dokular ve hücreleri tutmak. Mililitre de 0.2 miligram bir konsantrasyonda nagarse içeren mitokondriyal izolasyon tampon 13,5 mililitre ekleyin ve iki dakika boyunca dört santigrat derecede kıyılmış dokuları homojenize etmek için bir elektrikli homojener kullanın. Doku homojenates mitokondriyal izolasyon tampon başka üç mililitre ekleyin ve pipetleme tarafından iyice karıştırın.
Hazırlanan dokuyu 1, 300 xg ve 4 santigrat derecede 10 dakika homojen olarak santrifüj edin. Pelet çıkarın ve supernatant tutun. 10, 000 xg ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat de supernatant santrifüj.
Mikrozomları içeren supernatant çıkarın ve pelet tutmak. Daha sonra, mitokondriyal izolasyon tampon 2 mililitre ekleyin ve ışık pipetting tarafından iyice pelet yeniden askıya. Santrifüj bu pelet süspansiyon 7, 000 xg ve dört derece santigrat 10 dakika.
Supernatant atın ve ham mitokondri içeren pelet tutmak. Çıkarılan ham mitokondriyi yeniden askıya almak için %25 yoğunlukgradient ortamının 12 mililitresini ekleyin. Metin protokolünde belirtildiği gibi ham mitokondriyi içeren bir kesintili yoğunluk gradyanı yapın ve 52, 000 xg ve 4 santigrat derecede 90 dakika santrifüj edin.
25 ve %30 degrade ortamlar arasındaki arabirimden %34 ve %38 degrade ortamlar arasındaki arabirime kadar saflaştırılmış mitokondriyi toplamak için uzun ve künt bir şırınga kullanın. Saflaştırılmış mitokondriyi temiz bir tüpe aktarın. Toplanan mitokondriye mitokondriye mitokondri izolasyon tamponu ekleyerek üç kat hacimde seyreltin.
Santrifüj 15, 000 xg ve 20 dakika boyunca dört santigrat derece ve supernatant atın. Pelet ve santrifüjü 15, 000 xg ve 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca yeniden askıya almak için 2 mililitre mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin. Supernatant atın ve pelet tutun.
Son pelet toplamak ve 20 santigrat derece saklayın. Bu çalışmada, yüksek kaliteli mitokondriyal örnekler büyük ölçekli kantitatif proteomik ler için insan yumurtalık kanseri ve kontrol dokularından hazırlanır. Yumurtalık kanseri dokularından mitokondri hazırlanmasında ve farklı bir kesintili yoğunluk gradyanı kullanarak da dahil olmak üzere yumurtalık dokuları kontrol birkaç farklılıklar vardır.
Santrifüjden sonra, yumurtalık kanseri dokularından saflaştırılmış mitokondri%25 ile %30 arasında arayüz bulunurken, kontrol yumurtalık dokularından elde edilenler %25 ile %30 arasında arayüz den %34 ile %38 arasında arayüze kadar olan arabirimde bulunur, hazırlanan mitokondrinin kalitesi daha sonra elektroncopy ile diferansiyel hız santrifüjü ve yoğunluk gradyan santrifüj ile değerlendirilir. Elektron mikroskop görüntüleri hem yumurtalık kanserleri ve kontrol yumurtalık dokularında, ana organeller izole mitokondri olduğunu göstermektedir, peroksizomların küçük bir miktar dışında. Ancak, mitokondri morfolojisi yumurtalık kanserlerinde kontrol yumurtalık dokusu daha fazla değiştirmek için görülmektedir.
Hazırlanan mitokondrinin kalitesi de batı blotu ile değerlendirilir. Batı leke görüntüleri de yumurtalık kanserleri ve kontrol yumurtalıklardan hazırlanan mitokondriyal örneklerde ana bileşeni mitokondri olduğunu göstermektedir, peroksizomlar küçük bir miktar dışında, hangi elektron mikroskopisi analizi ile tutarlıdır. Peroksizomların hazırlanan mitokondride yer almasının makul olması, çünkü mitokondri peroksizomlarla yoğun bir şekilde etkileşir, bu da mitokondrinin fonksiyonel bütünlüğüyansıtır.
Bu sonuçlar hazırlanan mitokondriyal numunelerin yüksek kalitesini göstermektedir. Bu işlemi yaparken, homojenizasyondan önce dokuları tamamen kıymanız ve kıyma kontrol dokularına tripsin eklemeniz çok önemli. Kanser örnekleri ve kontroller için kesintisiz yoğunluk degradesi yapıp hazırlamanız da önemlidir.
Bu prosedürü takiben, yumurtalık kanseri mitokondri proteom profilini netleştirmek için iTRAQ veya TMT kantitatif proteomik veya fosfoproteomik yapılabilir ve fosfoproteom profili büyük derinliklerde yumurtalık kanserinde mitokondri lerin rollerini açıklığa kavuşturmak için kurulabilir. Bu teknik, araştırmacıların yumurtalık kanserinde mitokondri proteomu ve fosfoproteom üzerinde sistematik olarak çalışmalarının, sinyal yolu ağ sistemini oluşturmalarının ve güvenilir biyobelirteçleri ve tedavi hedeflerini keşfetmelerinin önünü açmaktadır.
