تم تصميم هذا البروتوكول لاكتشاف البكتيريا في أنسجة المبيض والتنبؤ بوظائفها. تم استخدام تلطيخ الكيمياء المناعية وتسلسل 16S rRNA ، من أجل اكتشاف وميز البكتيريا في أنسجة المبيض السرطانية وغير السرطانية في الموقع. ومن المتوقع التعويض والاختلافات الوظيفية للبكتيريا باستخدام BoPs والتحقيق الخلوي الوراثي للمجتمعات عن طريق إعادة بناء أيام غير منبه.
يهدف بروتوكولنا إلى استخراج البكتيريا من أنسجة المبيض في الموقع. ويمكن أيضا أن تستخدم لاكتشاف البكتيريا في الأورام من أي نوع. المزايا الرئيسية لبروتوكولنا هي أنه سهل ومريح ، وأنه يمكن تحقيقه في كل مختبر تقريبا.
كما أنه من السريع الحصول على النتائج. أثناء الممارسة في البروتوكول، من المهم استبعاد أي أنسجة ورم خارج الموقع. وبالتالي، يجب أن تكون جميع الإجراءات في هذا البروتوكول عقيمة.
أثناء الجراحة، يتم استئصال المبيضين المنفصلين إلى عينات أنسجة سميكة يبلغ سمكها سنتيمترا واحدا تقريبا مع زوج من الملاقط العقيمة الجديدة. تجنب لمس أي شيء آخر أثناء الإجراء بأكمله. بعد الانفصال، قم بإزالة العينة في أنبوب معقم ووضعها في النيتروجين السائل لانتقالها.
الحفاظ على العينات في ناقص 80 درجة مئوية. إصلاح الأنسجة عن طريق الفورمولين، ومن ثم تضمينها عن طريق البارافين. يمكن إيقاف هذا البروتوكول مؤقتا هنا.
يمكن الاحتفاظ بالأنسجة في درجة حرارة الغرفة للحفاظ عليها لفترة أطول. من أجل تشغيل مزيد من الخطوات، وقطع العينات في خمسة أقسام المسلسل ميكرومتر. ثم، وتجفيف العينات.
هل إزالة البارافين والإماهة للعينات. لاسترداد مستضد، هناك حاجة إلى علاج الميكروويف لمدة 10 دقائق في المخزن المؤقت EDTA. تراجع العينات في برنامج تلفزيوني الذي يحتوي على 0.3٪ الهيدروجين.
ت peroxidize لمدة 20 دقيقة لوقف نشاط البيروكسيديز الذاتية. أداء EMA الأجسام المضادة في LPS الأساسية، بتركيز 1 أكثر من 300. والحفاظ عليه لليلة واحدة في أربع درجات مئوية.
من أجل اكتشاف البكتيريا، استخدم مجموعة ركائز DAP للكشف عن وجود HRP. بناء على تعليمات الشركة المصنعة، استخدم HRP polymer، الأجسام المضادة للأرانب. استخدام جدول المكثف للسماح للأجسام المضادة الجمع الكامل.
استخدام برنامج تلفزيوني للقضاء على الأجسام المضادة غير المؤتلفة. قم بتلطيخ المادة الكيميائية الخاصة بك وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، ثم قم بمسح العينات تحت الماء. قم بالجفاف للعينات.
عينات البدلة عن طريق التوقيع. وأدخل كعينة باستخدام التصوير برو زائد إعداد مكتبة على أساس بروتوكول الشركة المصنعة. ممارسة نمط التمهيدي، الذي يتكون من تسلسل الجينات محددة ومحول Illumina فوق تسلسل النيوكليوتيدات.
لتضخيم معدلات المواليد لمنطقة V4 من 16s البكتيرية على تسلسل الجينات rRNA، تضخيم القالب من مدخلات عينة الحمض النووي باستخدام AMPLICON PCR. استخدام ماج بيند RxNPure Plus الخرز المغناطيسي لإزالة مزيج التفاعل من المنتج PCR. إجراء تضخيم PCR المفهرسة للمرة الثانية.
استخدم Agilent 2200 TapeStation للتحقق من المكتبة. استخدم QuantiFluor dsDNA النظام لتحديد حجم المكتبة. مع دورة 600، V3 خلية تدفق القياسية تنتج ما يقرب من 100، 000 ينتهي المقترنة.
2 × 300 قاعدة 3 يتم إزالة اللورق من المكتبات وتجميعها وتسلسلها. يتم تصنيف المعدلات الخام لكل عينة على أساس جودة التسلسل من قبل Trimmomatic.
يجب إزالة تسلسل التمهيدي والمحول. تسلسل يقرأ مع كل من الزوج والصفات أقل من 25 ينبغي تقصير. تحليل rRNA 16s من قبل حزمة البرمجيات QIIME.
جمع تسلسلات لتشكيل OTUs مع قطع التشابه في 97٪ ل OTUs، يجب حساب وفرة النسبية في كل عينة. توظيف مصنف بايزي، وهو في مجموعة التدريب RDP لفرز جميع التسلسلات. مع OTU معين، يتم تعيين تصنيف التي لديها التماسك الرئيسي للتسلسلات إلى OTUs.
يتم محاذاة OTUs إلى قاعدة بيانات سيلفا، مستندة إلى معلومات مجموعة عينة. أداء تنوع ألفا وتحليل الإحداثيات الأساسية المستندة إلى UniFrac. للتنبؤ بالعرض التقديمي المتعلق بخصائص البكتيريا استخدم BugBase.
توقع التركيب الوظيفي للميتاجينوم في PICRUSt. مع استخدام بيانات الرصد وقاعدة بيانات تحتوي على الجينوم المرجعي ، وتحليل وظائف مختلفة بين كل مجموعة بمساعدة برنامج STAMP. استخدم برنامج إحصائي واحد لحساب النتيجة.
وينبغي تحديد الإشارة إلى الأهمية الإحصائية على أنها p أقل من 0.05. حساب العوامل المحيرة، والتي تشمل العمر والتكافؤ، حسب اختبار الطالب t. حساب حالة انقطاع الطمث، وتاريخ ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري عن طريق اختبار تشي مربع.
حساب عدد من البكتيريا المبيض taxa بواسطة اختبار مان ويتني U. تم تسجيل 16 مريضا في هذه الدراسة. تم استخدام BugBase لممارسة تحليل الميتاجينومات المتوقعة.
الكيمياء الإمراضية والمناعية المحتملة للمبايض باستخدام الأجسام المضادة المضادة للبكتيريا LPS. يظهر هذا الرقم الثراء البكتيري والتنوع في مجموعات السرطان والسيطرة. كشفت عن طريق تسلسل 16S rRNA.
ويلاحظ أن الأرقام تشير إلى مؤشر الأنواع. مؤشر Chao1 ، مؤشر ACE ، مؤشر شانون ، مؤشر Evenness ، مؤشر سيمبسون ، على التوالي. تظهر الوفرة النسبية للفيلا والأنواع البكتيرية ال 12 الأكثر وفرة في عينات المبيض في هذا الرقم.
الشكل A، B، C و D.يعني وفرة النسبية للفريق في المبيضين من المرضى في مجموعة التحكم ومجموعة سرطان المبيض. وفرة النسبية من اثني عشر أنواع البكتيريا الأكثر وفرة في المبيضين من مرضى السيطرة ومجموعة سرطان المبيض. هذا هو الشائعات، تتجمع باستخدام PCoA والوفرة النسبية من Anoxynatronum سيبيريكوم وميثانوساركينا vacuolata.
ويبين الشكل ألف الأرقام الشائعة التي تم تجميعها باستخدام PCoA. يتم رسم PC1 و PC2 على x و المحور ص. الكتلة الحمراء تساوي العينة في مجموعة سرطان المبيض.
الدائرة الزرقاء تساوي عينة في مجموعة التحكم. يمكن فصل العينات من مجموعة سرطان المبيض عن عينات أخرى في مجموعة التحكم. ويبين الشكل باء الأرقام الشائعة التي تم تجميعها باستخدام PCoA.
يتم رسم PC1 و PC2 على محور س و ص. الكتلة الحمراء تساوي عينة في مجموعة سرطان المبيض. الدائرة الصلبة الزرقاء تساوي عينة من المريض المصاب بالورم النخاعي الرحمي.
والدائرة الزرقاء المجوفة تساوي عينة من مريض مصاب بداء الغدة الرحمية. ويبين الشكل جيم الوفرة النسبية لأنوكسيناترونوم سيبيريكوم. الشكل دال هو ميثانوساركينا فكولاتا.
هذا الرقم هو تحليل BugBase لعلم الجينوم الفوقي المتوقع. كان النمط الظاهري المحتمل للتحمل للإجهاد والأكسدة للمبايض في مجموعة السرطان أقوى من مجموعة التحكم. هذا الرقم يختلف اختلافا كبيرا KEGG مسار الفضاء بين السرطان ومجموعات التحكم من قبل PICRUSt التحليل.
عندما نحصل على عيناتنا، هناك حاجة إلى زوج من الملاقط العقيمة الجديدة. انتبه إلى التلوث المحتمل للعينات. أن البكتيريا خارج الموقع أنسجة الورم قد تؤثر على حل إلى حد كبير.
يتم تفضيل تعيين مجموعة التحكم إلى كل خطوة. من أجل الحد من تأثير التلوث المحتمل.
