قمنا بتطوير طريقة مبتكرة لمتقلبات الاستقلاب. جمعنا التصوير الطيفي لخلايا حيّة مع قياس الطيف الكتلي أحادي الخلية. يمكن لتقنيتنا مراقبة وتنبؤ التغيرات الأيضية للخلايا الفردية ضد الأدوية.
وهذا يفتح الكثير من التطبيق لأساسيات البحوث والصناعة. طريقتنا يضيف القرار خلية واحدة لتقنيات تقييم المخدرات الحالية التي سوف تساعد كثيرا في المستقبل جهود اكتشاف المخدرات. ويمكن أن تساعدنا تقنيتنا أيضًا على فهم الدور الذي تلعبه التجانس الخلوي في مقاومة السرطان.
إن أخذ العينات من خلية واحدة وتحليل البيانات هما أكثر الجوانب تحدياً في هذه التجربة. ونحن نعمل حاليا على أتمتة هاتين الخطوتين، وخاصة جزء أخذ العينات. نوصي بممارسة أخذ عينات الخلية الواحدة قبل التجربة، حيث أن كل إعداد ميكرومانيبولاتور مختلف قليلاً ويجب أن تأخذ الوقت للتعرف على عناصر التحكم.
بعد احتضان الخلايا للوصول إلى التقاء 70٪، والخلايا الثقافة من الفائدة في وسائل الإعلام المناسبة الثقافة، إضافة البنسلين-ستريبتوميسين لتجنب التلوث. بعد قياس كثافة الخلايا على مقياس الهيموسيت، خلايا الزراعة الفرعية في طبق شبكة قاع الزجاج 35 ملليمتر أو شرائح الكوارتز، باستخدام نفس المتوسطة بكثافة البذر من 0.7 مرة 10 إلى السادس. ثم احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي، الخلايا تصل إلى التقاء 50 إلى 60٪ غسل الخلايا مرتين مع العازلة برنامج تلفزيوني قبل warmed في 37 درجة مئوية. تقسيم الخلايا إلى مجموعات فرعية المخدرات المعالجة وغير المعالجة في أطباق ثقافة 35 ملليمتر. مزيج تاموكسيفين حل في ثنائيثيل السلفوكسيد مع وسائل الإعلام الثقافة للحصول على حجم النهائي من ملليلتر اثنين وتركيز تاموكسيفين من 10 ميكرومولار.
هذه هي المجموعة المعالجة من المخدرات امزج حجم المقابلة من DMSO في المتوسط كمجموعة مراقبة لدراسة آثار DMSO. احتضان كلتا المجموعتين في مليلترين من الوسائط ارتفعت لمدة 24 ساعة للوصول إلى التقاء 70 إلى 80٪ قبل القياسات الطيفية، والتحقق من ثقب الثقب ومباراة الليزر باستخدام هدف.
لمعايرة مقياس الطيف قبل كل تجربة، ضع الإيثانول في طبق قاع زجاجي، وقياس الطيف بكثافة ليزر معينة لثانية واحدة، وربط الذروة لأطوال موجية معروفة. ثم قم بإعداد الغرفة الدقيقة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. مرة واحدة في نظام المجهر جاهز، وإزالة الخلايا من الحاضنة وشطف الخلايا على الفور مرتين مع عازلة برنامج تلفزيوني دافئ في 37 درجة مئوية.
ثم أضف ملليلترين من برنامج تلفزيوني دافئ أو فلوروبريت DMEM. إضافة 10 ميكرولترات من الماء على عدسة الهدف الغمر المياه. ووضع بدقة طبق الخلية أسفل الزجاج على مرحلة المجهر.
إصلاح نظام أخذ عينات الخلايا على المجهر رامان. قم بتوصيل المايكرو مانايبولاتور ثلاثي الأبعاد بصاحب الشعر الشعري الزجاجي الذي يتم إرفاقه بحقنة فارغة لمص العينة. تعيين المجهر إلى حقل التكبير عالية من 40 مرات لمراقبة غيض من الشعرية الزجاجية، وتأكد من أنها ليست مكسورة.
السيطرة على موقف من الشعرية الزجاجية باستخدام micromanipulator. تأكد من أن رأس الشعيرات الدموية يتركز في مجال الرؤية. ثم نقل الشعيرات الدموية على محور Z لإعطاء إزالة طبق الثقافة في وقت لاحق.
ضع طبق العينة على خشبة المجهر، وضبط التكبير والتركيز، وحدد الخلية المستهدفة على طبق الشبكة، ونقلها إلى مركز الرؤية. قياس كل خلية من خلال التركيز على خط الليزر. ويكفي الوقت الذي يُعاني منه كل خلية 15 ثانية للحصول على مقطع عرضي من خلية مع إشارة Raman واضحة.
مرآة غالفانو يسمح المسح الضوئي لخلية واحدة أو مجموعة من الخلايا في غضون عدة عشرات من الدقائق. ثم خفض بعناية أسفل الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام micromanipulator حتى تلميح يأتي في التركيز. تحت المراقبة المجهرية، المس الخلية المفردة المستهدفة مع طرف الشعيرات الدموية.
ثم ابدأ في تطبيق الضغط السلبي باستخدام الحقنة لاعتراض الخلية داخل طرف الشعيرات الدموية. تسجيل هذا الإجراء عن طريق اتخاذ شريط فيديو للتحقق من توقيت وموقع امتص من الخلية على وجه التحديد. نقل الشعرية على محور Z.
ثم فصل الشعرية من حامل الشعيرات الدموية باستخدام ملقط استعدادا لتحليل الطيف الشامل. بعد إعداد أداة قياس الطيف الشامل وتحليل الوسائط ، أضف اثنين من ميكرولترات المذيبات المؤينة إلى الشعيرات الدموية التي تحتوي على الخلية. إصلاح الشعيرات الدموية إلى محول نانو كهربية متصلة بمطياف الكتلة مناسبة وبدء أسلوب الاستحواذ التلقائي.
ويرد هنا تحليل مقارن لمتوسط طيف كل حالة، مع العلاج من المخدرات أو بدونه. ويختلف متوسط طيف الشرطين بوضوح عند قمم مختلفة. على وجه الخصوص، فإن القمم في 1،000 في سنتيمتر واحد، وهو علامة على المركبات العطرية مثل الفينيلالين والتيروزين، تظهر اختلافات قوية.
واستناداً إلى الإسقاط على نموذج الهيكل الكامن، تم حساب درجات كبار الشخصيات التي تمثل أهمية الأطوال الموجية في التمييز بين الظروف التجريبية. الأهم من ذلك، تتوافق أعلى قمم ملفات تعريف كبار الشخصيات مع قمم رامان التي شوهدت اختلافات قوية بين العلاجين. وهذا ما أكد الاختلافات الجزيئية المحددة بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة.
بعد تحديد إيجابي ، تم قياس الوفرة النسبية للدواء واستقلابه في كل خلية ومقارنتها بالذرات الخلفية في الخلايا غير المعالجة. لوحظ تباين قوي في وفرة تاموكسيفين. وكانت هذه الظاهرة أكثر وضوحا في حالة المستقلب 4-هيدروكسي تاموكسيفين.
يمكن للباحثين أن يكونوا مهتمين باستكشاف الصلة بين الصور الطيفية وملامح التمثيل الغذائي للخلايا. كما أن أبحاثنا لها تطبيقات صناعية لأنها تسمح بالفحص المحلي للخلايا لتصنيع الأدوية. يجب توخي الحذر أثناء إعداد المذيبات المؤينة لقياسات مطياف الكتلة.
يجب أن تكون مستعدة تحت غطاء الدخان. أيضا، يجب الحرص على عدم لمس مصدر أيون من جهاز مطياف الشامل لتجنب التعرض للصعق بالكهرباء. وأخيراً، فإن الشعيرات الدموية المستخدمة في جميع أنحاء القياس حادة جداً، لذلك تعامل معها بعناية لتجنب الإصابة.
