Metabolomik için yenilikçi bir yöntem geliştirdik. Belfry spektral görüntülemesini tek hücreli kütle spektrometresi ile birleştirdik. Tekniğimiz ilaçlara karşı tek hücrelerin metabolik değişikliklerini izleyebilir ve tahmin edebilir.
Ve bu temel araştırma ve sanayi için bir çok uygulama açılır. Yöntemimiz, gelecekteki uyuşturucu keşif çabalarına büyük ölçüde yardımcı olacak mevcut ilaç değerlendirme tekniklerine tek hücreli çözüm ekler. Tekniğimiz aynı zamanda kanser direncinde hücresel heterojenliğin oynadığı rolü anlamamıza da yardımcı olabilir.
Tek hücreli örnekleme ve veri analizi bu deneyin en zorlu yönleridir. Şu anda bu iki adımı, özellikle de örnekleme kısmını otomatikleştirmek üzerinde çalışıyoruz. Her mikromanipülatör kurulumu biraz farklı olduğundan ve denetimleri tanımak için zaman ayırmanız gerektiğinden, denemeden çok önce tek hücreli örnekleme uygulamanızı öneririz.
Hücreleri %70'e ulaşmak için kuluçkaya yattıktan sonra, uygun bir kültür ortamına ilgi çeken kültür hücreleri, kontaminasyonu önlemek için Penisilin-Streptomisin ekleyin. Bir hemositometre üzerinde hücre yoğunluğu nu ölçtükten sonra, alt kültür hücreleri 35 milimetrelik cam alt ızgara çanak veya kuvars slaytlar içine, bir tohumlama yoğunluğu 0,7 kez 10 altıncı aynı ortamı kullanarak. Sonra 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.
Ertesi gün, hücreler %50 ila 60 arasında bir araya gelir önceden ısıtılmış PBS tamponuyla hücreleri iki kez yıkayın. 35 milimetrelik kültür yemeklerinde hücreleri ilaç tedavisi ve tedavi edilmeyen alt gruplara bölün. Mix Tamoxifen dimetil sülfoksit içinde kültür medya ile iki mililitre ve 10 mikromolar Tamoxifen konsantrasyonu son bir hacim elde etmek için çözülmüş.
Bu ilaç tedavi grubu. DMSO'nun etkilerini incelemek için bir kontrol grubu olarak ortama karşılık gelen bir DMSO hacmini karıştırın. Her iki grubu da 24 saat boyunca sivri uçlu ortamın iki mililitresinde kuluçkaya yatırArak spektral ölçümlerden önce %70 ila %80'lik bir kesişmeye ulaşın, iğne deliği ve lazer pozisyonu eşleşmesini bir hedef kullanarak doğrulayın.
Her deneyden önce spektrofotometreyi kalibre etmek için, etanolü cam bir alt çanağa yerleştirin, belirli bir lazer yoğunluğunda bir saniye boyunca tayfı ölçün ve tepeyi bilinen dalga boylarına bağlayın. Sonra mikro odayı %5 karbondioksit ve 37 santigrat dereceye sabitle. Mikroskop sistemi hazır olduğunda, hücreleri kuvözden çıkarın ve hücreleri 37 santigrat derecede ısıtılmış PBS tamponuyla iki kez durulayın.
Sonra ısıtılmış PBS veya FloroBrite DMEM iki mililitre ekleyin. Su daldırma objektif üzerine 10 mikrolitre su ekleyin. Ve incelikle mikroskop aşamasına cam alt hücre çanak yerleştirin.
Hücre örnekleme sistemini Raman mikroskobuna sabitle. 3D mikromanipülörü, numune emmeiçin boş bir şırıngaya bağlı olan cam kılcal tutucuya bağlayın. Cam kılcal damarucunu gözlemlemek için mikroskobu 40 kat yüksek büyütme alanına ayarlayın ve kırılmadığından emin olun.
Mikromanipülatör kullanarak cam kılcal pozisyonu kontrol edin. Kılcal uç görüş alanında ortalanmış olduğundan emin olun. Daha sonra kültür çanak için açıklık vermek için Z-ekseni üzerinde kılcal yukarı taşıyın.
Örnek kabı mikroskop un sahnesine yerleştirin, büyütme ve odaklamayı ayarlayın, ızgara çanağı üzerindeki hedef hücreyi seçin ve görüş merkezine taşıyın. Lazer çizgisini odaklayarak her hücreyi ölçün. Hücre başına 15 saniyelik maruz kalma süresi net raman sinyali olan bir hücrenin kesitini elde etmek için yeterlidir.
Bir galvano-ayna birkaç düzine dakika içinde bir hücre veya hücre grubu tarama sağlar. Daha sonra dikkatlice ucu odak haline gelene kadar mikromanipülatör kullanarak cam kılcal aşağı indirin. Mikroskobik gözlem altında, kılcal ucu ile hedef tek hücreye dokunun.
Sonra kılcal ucu içinde hücre tuzak şırınga kullanarak negatif basınç uygulamaya başlayın. Tam olarak hücrenin zamanlamasını ve emdi konumunu kontrol etmek için bir video alarak bu yordamı kaydedin. Kılcal damarı Z ekseninde yukarı doğru hareket ettirin.
Daha sonra kapilleri kitle spektrometresi analizine hazırlanmak için forseps kullanarak kılcal damar tutucudan ayırın. Kütle spektrometresi aletini kurduktan ve ortamı analiz ettikten sonra, hücreyi içeren kılcal damara iyonizasyon çözücüsünün iki mikrolitresini ekleyin. Kapilleri uygun bir kütle spektrometresine bağlı bir nano-elektrosprey adaptörüne sabitle ve otomatik satın alma yöntemini başlatın.
Burada, ilaç tedavisi olan ve olmayan her durumun ortalama spektrumunun karşılaştırmalı bir analizi gösterilmiştir. İki koşulun ortalama spektrumu çeşitli zirvelerde açıkça farklılık gösterir. Özellikle fenilalanin ve tirozin gibi aromatik bileşiklerin bir işareti olan 1,000 santimetredeki zirveler güçlü farklılıklar gösterir.
Gizli yapı modelindeki projeksiyona göre, deneysel koşulların ayırt edilebilmesinde dalga boylarının önemini temsil eden VIP puanları hesaplanmıştır. Daha da önemlisi, VIP profillerinin en yüksek zirveleri raman zirvelerine karşılık gelirken, iki tedavi arasında güçlü farklılıklar görüldü. Bu tedavi ve tedavi edilmemiş hücreler arasındaki özel moleküler farklılıkları doğruladı.
Pozitif tanımlamadan sonra, ilacın ve metabolitlerinin göreceli bolluğu her hücrede ölçüldü ve tedavi edilmeyen hücrelerdeki arka plan zirvelerine göre karşılaştırıldı. Tamoksifen bolluğunda güçlü bir varyasyon gözlendi. Ve bu fenomen, 4-hidroksi-tamoksifen metaboliti durumunda daha da belirgindi.
Araştırmacılar spektral görüntüler ve hücrelerin metabolik profilleri arasındaki bağlantıyı keşfetmek ilginizi çekebilir. Farmasötik üretim için hücrelerin yerel tarama için izin verir, çünkü bizim araştırma da endüstriyel uygulamalar vardır. Kütle spektrometre ölçümleri için iyonizasyon çözücühazırlanırken dikkatli olunmalıdır.
Duman kaputunun altında hazırlanmalı. Ayrıca, elektrik çarpmasını önlemek için kütle spektrometre aletinin iyon kaynağına dokunmamaya dikkat edin. Son olarak, ölçüm boyunca kullanılan örnekleme kılcal damarlar çok keskin, bu yüzden yaralanmayı önlemek için dikkatli bir şekilde bunları ele.
