פיתחנו שיטה חדשנית למטבולומיה. שילבנו את ההדמיה הספקטרלית של בלפרי של תאים חיים עם ספקטרומטריית מסה חד-תאית. הטכניקה שלנו יכולה לפקח ולחזות את השינויים המטבוליים של תאים בודדים נגד תרופות.
וזה פותח הרבה יישום למחקר יסודות ותעשייה. השיטה שלנו מוסיפה רזולוציה חד-תאית לטכניקות הנוכחיות להערכת סמים אשר יסייעו מאוד למאמצי גילוי תרופות עתידיים. הטכניקה שלנו יכולה גם לעזור לנו להבין את התפקיד שמילאה הטרוגניות תאית בהתנגדות לסרטן.
הדגימה החד-תאית וניתוח הנתונים הם ההיבטים המאתגרים ביותר בניסוי זה. אנו עובדים כעת על הפיכת שני שלבים אלה לאוטומטיים, במיוחד החלק של הדגימה. אנו ממליצים לך לתרגל את הדגימה של תא יחיד הרבה לפני הניסוי, כמו כל הגדרת micromanipulator הוא שונה במקצת ואתה צריך לקחת את הזמן כדי להכיר את הפקדים.
לאחר דגירה תאים להגיע 70%confluency, תאי תרבות של עניין במדיה תרבותית מתאימה, להוסיף פניצילין-סטרפטומיצין כדי למנוע זיהום. לאחר מדידת צפיפות התאים בהמוציטמטר, תאי תת-תרבות לצלחת רשת תחתונה של 35 מילימטר זכוכית או מגלשות קוורץ, תוך שימוש באותו מדיום בצפיפות זריעה של פי 0.7 10 עד השישי. ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
למחרת, התאים מגיעים לקונפליה של 50 עד 60% לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ PBS מחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס. מחלקים את התאים לקבוצות משנה שטופלו בסמים ולא מטופלים במנות תרבות של 35 מילימטר. מערבבים טמוקסיפן מומס דימתיל סולפוקסיד עם התקשורת התרבותית כדי להשיג נפח סופי של שני מיליליטר וריכוז טמוקסיפן של 10 micromolar.
זו הקבוצה שטופלה בסמים. ערבבו נפח תואם של DMSO למדיום כקבץ בקרה כדי לחקור את ההשפעות של DMSO. דגירה שתי הקבוצות בשני מיליליטר של התקשורת זינק במשך 24 שעות כדי להגיע לקונפליה של 70 עד 80% לפני מדידות ספקטרליות, לאמת את חור הסיכה ואת מיקום הלייזר להתאים באמצעות יעד.
כדי לכייל את הספקטרופוטומטר לפני כל ניסוי, מניחים אתנול בצלחת תחתונה מזכוכית, מודדים את הספקטרום בעוצמת לייזר נתונה לשנייה אחת, ומקשרים את הפסגה לאורכי גל ידועים. ואז להגדיר את תא מיקרו ב 5% פחמן דו חמצני ו 37 מעלות צלזיוס. לאחר שמערכת המיקרוסקופ מוכנה, מוציאים תאים מהאינקובטור ומיד שוטפים תאים פעמיים עם חיץ PBS מחומם ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של PBS מחומם או FluoroBrite DMEM. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של מים לעדשה האובייקטיבית של טבילת המים. ומ מניחים בעדינות את צלחת התא התחתון של הזכוכית על שלב המיקרוסקופ.
תקן את מערכת דגימת התאים במיקרוסקופ של אמן. חבר את המיקרומניפולטור תלת-מימדי למחזיק נימי הזכוכית המחובר למזרק ריק למצצת דגימה. הגדר את המיקרוסקופ לשדה הגדלה גבוה של 40 פעמים כדי לבחון את קצה נימי הזכוכית, ולוודא שהוא לא שבור.
לשלוט על המיקום של נימי הזכוכית באמצעות מיקרומניפולטור. ודא כי קצה נימי מרוכז בשדה המבט. ואז להזיז את נימי על ציר Z כדי לתת אישור עבור צלחת התרבות מאוחר יותר.
מניחים את צלחת הדגימה על שלב המיקרוסקופ, מתאימים את ההגדלה והמיקוד, בוחרים את תא היעד בצלחת הרשת ומעבירים אותו למרכז הנוף. למדוד כל תא על ידי מיקוד קו הלייזר. זמן חשיפה של 15 שניות לכל תא מספיק כדי להשיג חתך רוחב של תא עם אות אמן ברור.
מראה גלוונו מאפשרת סריקה של תא אחד או קבוצת תאים בתוך כמה עשרות דקות. ואז בזהירות להוריד את נימי הזכוכית באמצעות מיקרומניפולטור עד הקצה נכנס לפוקוס. תחת תצפית מיקרוסקופית, לגעת בתא היעד יחיד עם קצה נימי.
ואז להתחיל להפעיל לחץ שלילי באמצעות המזרק כדי ללכוד את התא בתוך קצה נימי. הקלט הליך זה על-ידי צילום וידאו כדי לבדוק את התזמון ואת המיקום המוצץ של התא במדויק. הזז את נימי על ציר Z.
לאחר מכן נתק את נימי ממחזיק נימי באמצעות מדפים כהכנה לניתוח ספקטרומטריית מסה. לאחר הגדרת מכשיר ספקטרומטריית המסה וניתוח המדיה, מוסיפים שני מיקרוליטרים של ממס היוניזציה ל נימי המכיל את התא. תקן את נימי מתאם ננו-אלקטרוספריי מחובר ספקטרומטר מסה מתאים ולהתחיל את שיטת הרכישה האוטומטית.
ניתוח השוואתי של הספקטרום הממוצע של כל מצב, עם וללא טיפול תרופתי, מוצג כאן. הספקטרום הממוצע של שני התנאים שונה בבירור בפסגות שונות. בפרט, הפסגות ב 1, 000 אחוז סנטימטר, שהוא סימן תרכובות ארומטיות כגון פנילאלנין טירוזין, להראות הבדלים חזקים.
בהתבסס על ההקרנה על מודל מבנה סמוי, ציוני VIP חושבו המייצגים את החשיבות של אורכי גל באפליית התנאים הניסיוניים. חשוב לציין, הפסגות הגבוהות ביותר של פרופילי VIP התאים לפסגות רמן אשר הבדלים חזקים נראו בין שני הטיפולים. זה אישר את ההבדלים המולקולריים הספציפיים בין תאים מטופלים ולא מטופלים.
לאחר זיהוי חיובי, השפע היחסי של התרופה ומטבוליטים שלה נמדדו בכל תא בהשוואה לפסגות רקע בתאים לא מטופלים. וריאציה חזקה נצפתה בשפע טמוקסיפן. ותופעה זו הייתה בולטת עוד יותר במקרה של מטבוליט 4-הידרוקסי-טמוקסיפן שלה.
חוקרים יכולים להיות מעוניינים לחקור את הקשר בין תמונות ספקטרליות לבין פרופילים מטבוליים של תאים. המחקר שלנו יש גם יישומים תעשייתיים כי זה מאפשר סינון מקומי של תאים לייצור תרופות. יש לדאוג בעת הכנת ממס היונים למדידות ספקטרומטר המסה.
זה צריך להיות מוכן מתחת למכסה המנוע של אדים. כמו כן, היזהר לא לגעת במקור היון של מכשיר ספקטרומטר המסה כדי למנוע התחשמלות. לבסוף, נימי הדגימה המשמשים לאורך כל המדידה הם חדים מאוד, אז לטפל בהם בזהירות כדי למנוע פציעה.
