Desenvolvemos um método inovador para metabolômica. Combinamos a imagem espectral de Belfry de células vivas com espectrometria de massa unicelular. Nossa técnica pode monitorar e prever as mudanças metabólicas de células únicas contra drogas.
E isso abre muita aplicação para pesquisa básica e indústria. Nosso método adiciona resolução unicelular às técnicas atuais de avaliação de medicamentos que ajudarão muito os esforços futuros de descoberta de drogas. Nossa técnica também pode nos ajudar a entender o papel desempenhado pela heterogeneidade celular na resistência ao câncer.
A amostragem unicelular e a análise de dados são os aspectos mais desafiadores deste experimento. No momento, estamos trabalhando na automatização dessas duas etapas, especialmente a parte amostral. Recomendamos que você pratique a amostragem unicelular bem antes do experimento, pois cada configuração de micromanipulador é ligeiramente diferente e você deve ter tempo para se familiarizar com os controles.
Depois de incubar células para atingir 70% de confluência, células de cultura de interesse em uma mídia cultural apropriada, adicionam Penicilina-Streptomicina para evitar contaminação. Depois de medir a densidade celular em um hemótmetro, as células de subcultura em uma placa de grade de vidro de 35 milímetros ou slides de quartzo, usando o mesmo meio em uma densidade de semeadura de 0,7 vezes 10 a sexta. Em seguida, incubar a 37 graus celsius por 24 horas.
No dia seguinte, as células atingem uma confluência de 50 a 60% Lave as células duas vezes com tampão PBS pré-aquecido a 37 graus celsius. Divida as células em subgrupos tratados com drogas e não tratados em pratos de cultura de 35 milímetros. Misture o Tamoxifen dissolvido em sulfóxido de dimetila com a mídia cultural para obter um volume final de dois mililitros e concentração de Tamoxifen de 10 micromolar.
Este é o grupo tratado com drogas. Misture um volume correspondente de DMSO ao meio como um grupo de controle para estudar os efeitos do DMSO. Incubar ambos os grupos em dois mililitros da mídia cravada por 24 horas para atingir uma confluência de 70 a 80%Antes das medições espectrais, verifique o pinhole e a posição do laser correspondendo usando um alvo.
Para calibrar o espectrofotômetro antes de cada experimento, coloque o etanol em uma placa de fundo de vidro, meça o espectro em uma dada intensidade de laser por um segundo, e associe o pico a comprimentos de onda conhecidos. Em seguida, configure a micro-câmara a 5% de dióxido de carbono e 37 graus celsius. Uma vez que o sistema de microscópio esteja pronto, remova as células da incubadora e enxágue imediatamente as células duas vezes com tampão PBS aquecido a 37 graus celsius.
Em seguida, adicione dois mililitros de PBS aquecido ou FluoroBrite DMEM. Adicione 10 microliters de água na lente objetiva de imersão de água. E coloque delicadamente a placa de vidro inferior da célula no palco do microscópio.
Fixar o sistema de amostragem celular no microscópio Raman. Conecte o micromanípulador 3D ao suporte capilar de vidro que está preso a uma seringa vazia para sugação de amostras. Coloque o microscópio em um campo de alta ampliação de 40 vezes para observar a ponta do capilar de vidro e certifique-se de que ele não está quebrado.
Controle a posição do capilar de vidro usando o micromanipulador. Certifique-se de que a ponta capilar está centrada no campo de visão. Em seguida, mova o capilar para cima no eixo Z para dar folga para o prato de cultura mais tarde.
Coloque o prato de amostra no estágio do microscópio, ajuste a ampliação e o foco, selecione a célula alvo na folha da grade e mova-a para o centro de visão. Meça cada célula focando a linha laser. Um tempo de exposição de 15 segundos por célula é suficiente para obter uma seção transversal de uma célula com um sinal raman claro.
Um espelho galvano permite a varredura de uma célula ou de um grupo de células dentro de várias dezenas de minutos. Em seguida, abaixe cuidadosamente o capilar de vidro usando micromanipulador até que a ponta entre em foco. Sob observação microscópica, toque na célula única alvo com a ponta capilar.
Em seguida, comece a aplicar pressão negativa usando a seringa para prender a célula dentro da ponta capilar. Registo este procedimento fazendo um vídeo para verificar o tempo e a localização sugada da célula com precisão. Mova o capilar para cima no eixo Z.
Em seguida, desvincule o capilar do titular capilar usando fórceps em preparação para análise de espectrometria de massa. Após a configuração do instrumento de espectrometria de massa e análise da mídia, adicione dois microliters do solvente de ionização ao capilar que contém a célula. Fixar o capilar em um adaptador nano-eletrospray conectado a um espectrômetro de massa adequado e iniciar o método de aquisição automática.
Uma análise comparativa do espectro médio de cada condição, com e sem tratamento medicamentoso, é mostrada aqui. O espectro médio das duas condições difere claramente em vários picos. Em particular, os picos de 1.000 por centímetro, que é um sinal para compostos aromáticos como fenilalanina e tyrosina, mostram fortes diferenças.
Com base na projeção do modelo de estrutura latente, foram calculados os escores VIP que representam a importância dos comprimentos de onda na discriminação das condições experimentais. É importante ressaltar que os picos mais altos dos perfis VIP corresponderam aos picos de Raman para os quais foram observadas fortes diferenças entre os dois tratamentos. Isso confirmou as diferenças moleculares específicas entre células tratadas e não tratadas.
Após identificação positiva, a abundância relativa da droga e seus metabólitos foram medidos em cada célula e comparados com picos de fundo em células não tratadas. Observou-se forte variação na abundância de Tamoxifen. E este fenômeno foi ainda mais pronunciado no caso de seu metabólito 4-hidroxi-tamoxifen.
Os pesquisadores podem estar interessados em explorar a ligação entre imagens espectrais e os perfis metabólicos das células. Nossa pesquisa também tem aplicações industriais porque permite a triagem local de células para fabricação farmacêutica. Deve-se tomar cuidado durante a preparação do solvente de ionização para as medições do espectrômetro de massa.
Deve ser preparado sob um capô de fumaça. Além disso, tenha cuidado para não tocar na fonte de íon do instrumento espectrômetro de massa para evitar ser eletrocutado. Finalmente, os capilares amostrais utilizados ao longo da medição são muito afiados, por isso manuseie-os com cuidado para evitar lesões.
