يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد التوزيع الأساسي للخلايا الجذعية الفصية بعد التسليم داخل الأنف إلى الدماغ. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التي تسهل التسليم غير الغازية وتتبع الخلايا الجذعية الميسينيمال إلى الدماغ. أيضا، جرعات متعددة ممكنة لتحقيق أقصى قدر من الآثار العلاجية للخلايا المزروعة في مرحلة مزمنة بعد الإصابات.
هذه التقنية تزيد من عدد الخلايا التي يتم تسليمها إلى موقع الإصابة وتقلل من تطور الخلية اللوائية إلى أنسجة أخرى. على الرغم من أن هذه التقنية توفر نظرة ثاقبة على استخدام الخلايا الجذعية الليسينشيمال في علاجات إصابات الدماغ الرضية، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم للتحقيق في إصابات الدماغ غير الرضية. بالنسبة للخلايا الجذعية السينيشيمالية التي تحمل علامات مع أكسيد الحديد شبه المهاج فائقة، أضف ستة ملليلترات من وضع العلامات المتوسطة إلى 80٪ من ثقافة الخلايا الجذعية الميمية في قارورة T 75 لاحتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم التالي، بعناية التعرق وناتن السوبر وغسل الخلايا مرتين مع ستة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل. لتحديد ما إذا كانت الخلايا قد تم تصنيفها بنجاح، تحقق من الثقافة تحت مجهر الفلورسنت. للحث على إصابة CCI ، بعد التأكد من عدم الاستجابة لردود الفعل الدواسة ، استخدم المقصات الإلكترونية لحلاقة الفراء من السطح الظهري للجمجمة ، وتنظيف المنطقة الحليقة عدة مرات مع مسحة قطنية معقمة غارقة في اليود.
استخدام مسحة القطن غارقة في 70٪ الإيثانول لإزالة اليود بعد مسحة الماضي ووضع الحيوان في إطار مجسم. قم بتأمين الفأرة باستخدام قضبان الأذن والأنف، واصنع شقًا متوسط المستوى في الجلد الحليق 2.5 سنتيمترًا للوصول إلى سطح الجمجمة. استخدام وسادة القطن لإزالة الأنسجة التي تغطي الجمجمة وتنظيف سطح الجمجمة لمدة 10 ثوان مع مسحة القطن غارقة مع بيروكسيد الهيدروجين 3٪.
جفف الجمجمة بلوحة قطنية طازجة واستخدم قلم رصاص لرسم دائرة أربعة ملليمترات حول الإحداثيات المختارة على العظام المكشوفة. باستخدام حفر صغيرة مجهزة 0.5 ملليمتر قطرها جولة بور، رقيقة بعناية الجمجمة في دائرة ملحوظ دون الضغط. إزالة أي غبار العظام مع مسحة القطن نظيفة وجافة واستخدام ملقط معقم قدم لإزالة بعناية رفرف العظام الناتجة.
عندما تم كشف ماطر دورا، نقل الماوس إلى إطار مجسم من جهاز CCI، وتأمين الحيوان مع قضبان الأذن والأنف بحيث يكون مستوى الرأس في اتجاه rostrocaudal. باتباع التعليمات الموجودة على مربع التحكم، صفر طرف الارتطام إلى السطح القشري المكشوف باستخدام عجلات التحكم X و Y على قاعدة المؤثرات لمحاذاة طرف التأثير مباشرة فوق إحداثيات القشرة المطلوبة ليتم التأثير عليها. استخدم مربع التحكم لتعيين معلمات التجربة إلى سرعة قدرها خمسة أمتار في الثانية، ووقت الإقامة 250 مللي ثانية، وعمق الإصابة من ملليمتر واحد للحث على إصابة خفيفة.
ثم اضغط على زر التأثير الموجود في مربع التحكم. مسحة أي نزيف يحدث مع مسحة القطن العقيمة وإزالة الماوس من الإطار. أغلق الشق مع الغرز الجراحية الحريرية وتطبيق المضادات الحيوية الموضعية على الموقع قبل وضع الماوس على وسادة التدفئة مع المراقبة حتى إعادة شغل كامل.
بعد يوم واحد من الإصابة، علاج أكسيد الحديد شبه المهاج السوبر المسمى ثقافة الخلايا الجذعية mesenchymal مع ثلاثة ملليلتر من التربسين. بعد خمس دقائق في 37 درجة مئوية، بدء التفاعل مع سبعة ملليلتر من متوسط DMEM قبل الدافئة، تستكمل مع مصل الأبقار الجنينية 10٪، وجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في برنامج تلفزيوني للعد.
ثم، ضبط تركيز الخلية إلى 1.5 مرات 10 إلى الخلايا الخمس لكل 18 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. لتسليم الخلية، بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القارص، scruff الماوس في حين شل الجمجمة. ضع طرف ماصة تحتوي على أربع وحدات من الهيالورونيداز لكل ميكرولتر من PBS بالقرب من نار الماوس بزاوية 45 درجة ، وادارة ثلاثة ميكرولترات من تعليق الهيالورونيداز في كل انخر.
ضع وجه الحيوان على وسادة نظيفة لمدة خمس دقائق قبل تكرار العلاج أربع مرات لما مجموعه 100 وحدة من علاج الهيالورونيداسي. بعد العلاج الأخير، ضع الماوس مرة أخرى على لوحة لمدة 30 دقيقة، قبل كبح جماح الماوس كما أظهرت للتو. مع رئيس شل الحركة، وإدارة ثلاثة microliters من تعليق الخلايا الجذعية mesenchymal في كل منخر على مدى فترة ثلاث ثوان لكل تسليم الحل، وعقد الماوس في موقف لمدة 30 ثانية حتى قطرات العينة قد اختفت تماما.
بعد دقيقتين، كرر التسليم حتى ثلاث مرات حتى تم تسليم كامل حجم الخلايا الجذعية الميسينيمال. ثم، العودة الماوس إلى قفص مع المراقبة حتى إعادة شغل كامل. لتتبع هجرة الخلايا الجذعية الميسينية بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي، ضع الماوس المُجَنَّد على حامل التصوير في جهاز التصوير MR.
ثم، تأمين الحيوان في مكان ونقل حامل إلى مركز لفائف التصوير بالرنين المغناطيسي. تعيين وقت التكرار إلى 1500 مللي ثانية ووقت الصدى إلى 2.8 مللي ثانية. ثم، تعيين مجال الرؤية إلى 16 في 16 ملليمتر، ومصفوفة الاستحواذ إلى 128 في 128، وسمك الشريحة إلى 0.75 في 0.8 ملليمتر مع أربعة متوسطات إشارة وزاوية الوجه 90 درجة للحصول على مسح نجمة T2 المرجح باستخدام تسلسل صدى تدور.
بعد الانتهاء من عمليات المسح الضوئي، اسحب حامل الماوس من مركز ملف التصوير بالرنين المغناطيسي ، وارجع الماوس إلى قفصه مع المراقبة حتى إعادة شغل الوظائف بالكامل. لتتبع وتحديد الخلايا الجذعية mesenchymal المسمى على الصور المرجحة نجمة T2، افتح البيانات في برنامج المحاذاة حالة تكنولوجيا المعلومات وحدد التسمية النشطة. لإنشاء تجزئة مناطق hypointense وآفة أو أجزاء أخرى من الدماغ من الفائدة، وذلك باستخدام ألوان التسمية المختلفة لكل قطعة.
استخدام أداة المضلع في شريط الأدوات الرئيسية لتحديد المناطق hypointense التي تمثل أكسيد الحديد السوبر شبه المهاج المسمى الخلايا الجذعية mesenchymal وانقر فوق قبول. ستظهر المساحات المجزأة بنفس لون التسمية النشطة المعينة إلى تلك الشريحة المعينة. عندما تم تقسيم جميع الشرائح، استخدم أداة المشرط لتطوير خريطة ثلاثية الأبعاد للمناطق المجزأة لتمثيل توزيع الخلايا الجذعية الميسينيمال في الدماغ بأكمله.
لإجراء تحليل كمي لمتوسط الحجم والكثافة في مناطق hypointense المجزأة التي تمثل الخلايا المسماة، انقر فوق التجزئة وحدد الحجم والإحصائيات. بعد 24 ساعة من التسليم داخل الأنف، يتم الكشف عن أكسيد الحديد شبه المهاج فائق المسمى الخلايا الجذعية mesenchymal كما المناطق hypointense قوية منتصف إلى إصابة القشرية على الصور نجمة T2 مرجح، مما يشير إلى الهجرة المستهدفة من أكسيد الحديد بارامغناطيسي السوبر إلى موقع الإصابة. ولا تزال هذه الهجرة ظاهرة للعيان حتى 14 يوماً بعد التسليم دون أي انخفاض ملحوظ في الإشارة.
الحيوانات المصابة المعالجة مع برنامج تلفزيوني لا يعرض مناطق hypointense في أي وقت، مشيرا إلى أن المناطق hypointense لاحظت تتوافق مع أكسيد الحديد بارامغناطيسي فائقة المسمى الخلايا الجذعية mesenchymal، وليس بسبب القطع الأثرية إشارة. يمكن تصور التوزيع الحيوي للخلايا الجذعية mesenchymal المسمى باستخدام إعادة الإعمار 3D، أنسجولوجيا من قبل البلط الأزرق البروسي، أو عن طريق الكشف عن فلوروسنس من فيت سي الموسومة أكسيد الحديد شبه المغناطيسي في الخلايا الجذعية mesenchymal المسمى. تأكد من التحقق من صحة نتائج التصوير بالرنين المغناطيسي مع علم التجميل أو أساليب أخرى.
كما يمكن أن تبقى جزيئات أكسيد الحديد المغناطيسي السوبر في الأنسجة بعد وفاة الخلية، مما يؤدي إلى إشارات إيجابية كاذبة. بعد هذا الإجراء، يمكن تطبيق التتبع المعتدل غير الغازي المحتمل في القياس الكمي للإجابة على الأسئلة المتعلقة بشحذ القدرات والاحتفاظ بالخلايا الجذعية السينية في الدماغ. بعد هذا التطور، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الطب التجديدي لاستكشاف طرق تحسين شحذ الخلايا إلى مناطق محددة من الدماغ.
