Este método pode ajudar a determinar a distribuição base da célula-tronco lobitica após a entrega intranasal ao cérebro. A principal vantagem dessa técnica é que facilita o parto não invasivo e o rastreamento de células-tronco mesenquimais para o cérebro. Além disso, as múltiplas doses são possíveis para maximizar os efeitos terapêuticos das células transplantadas no estágio crônico após as lesões.
Essa técnica maximiza o número de células entregues ao local da lesão e minimiza a progressão das células lobiticas em outros tecidos. Embora esta técnica forneça uma visão sobre o uso de células-tronco mesenquimais em terapias traumáticas de lesão cerebral, ela também pode ser usada para a investigação de lesões cerebrais não traumáticas. Para rotulagem de células-tronco mesenquimais com óxido de ferro super paramagnético, adicione seis mililitros de rotulagem média a uma cultura de células-tronco mesenquimais 80% confluentes em um frasco T 75 para uma incubação de 24 horas a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte, aspire cuidadosamente o super natant e lave as células duas vezes com seis mililitros de PBS por lavagem. Para determinar se as células foram rotuladas com sucesso, verifique a cultura sob um microscópio florescente. Para induzir uma lesão de CCI, após confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, use cortadores eletrônicos para raspar a pele da superfície dorsal do crânio, e limpar a área raspada várias vezes com um cotonete estéril encharcado em iodo.
Use um cotonete encharcado em 70% de etanol para remover o iodo após o último cotonete e coloque o animal em uma moldura estereotática. Fixar o mouse com as barras de ouvido e nariz e fazer uma incisão de 2,5 centímetros médios na pele raspada para acessar a superfície do crânio. Use uma almofada de algodão para remover o tecido que cobre o crânio e limpar a superfície do crânio por 10 segundos com um cotonete encharcado com 3% de peróxido de hidrogênio.
Seque o crânio com uma almofada de algodão fresco e use um lápis para desenhar um círculo de quatro milímetros em torno das coordenadas de escolha no osso exposto. Utilizando uma micro broca equipada com uma broca redonda de 0,5 milímetros de diâmetro, afina cuidadosamente o crânio no círculo marcado sem aplicar pressão. Remova qualquer pó ósseo com um cotonete de algodão limpo e seco e use fórceps estéreis para remover cuidadosamente a aba óssea resultante.
Quando a dura-mater tiver sido exposta, transfira o mouse para o quadro estereotático do dispositivo CCI e fixe o animal com as barras de ouvido e nariz para que a cabeça esteja nivelada na direção rostrocaudal. Seguindo as instruções na caixa de controle, zero a ponta impactante à superfície cortical exposta usando as rodas de controle X e Y na base do impactador para alinhar a ponta impactor diretamente acima das coordenadas do córtex desejada a serem impactadas. Use a caixa de controle para definir os parâmetros do experimento a uma velocidade de cinco metros por segundo, um tempo de permanência de 250 milissegundos e profundidade de lesão de um milímetro para induzir uma lesão leve.
Em seguida, pressione o botão de impacto na caixa de controle. Co swab qualquer sangramento que ocorra com um cotonete estéril e remova o rato da moldura. Feche a incisão com suturas cirúrgicas de seda e aplique antibióticos tópicos no local antes de colocar o mouse em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recumbência total.
Um dia após a lesão, trate o óxido de ferro super paramagnético rotulado cultura de células-tronco mesenquimais com três mililitros de trippsina. Após cinco minutos a 37 graus Celsius, inicie a reação com sete mililitros de meio DMEM pré-aquecido, complementado com soro bovino 10% fetal e colete a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mililitros. Sedimentar as células por centrifugação e suspender a pelota na PBS para contagem.
Em seguida, ajuste a concentração celular para 1,5 vezes 10 para as cinco células por 18 microliters de PBS. Para a entrega do celular, depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do sol, escrotou o mouse enquanto imobiliza o crânio. Coloque a ponta de uma pipeta contendo quatro unidades de hialuronidase por microlitra de PBS perto da nare do rato em um ângulo de 45 graus, e administre três microlitros de suspensão de hialuronidase em cada narina.
Coloque o animal de frente para cima em uma almofada limpa por cinco minutos antes de repetir o tratamento quatro vezes para um total de 100 unidades de tratamento de hialuronidase. Após o último tratamento, coloque o mouse de volta na almofada por 30 minutos, antes de conter o mouse como apenas demonstrado. Com a cabeça imobilizada, administre três microlitadores da suspensão de células-tronco mesenquimais em cada narina durante um período de três segundos por entrega de solução, mantendo o mouse em posição por 30 segundos até que as gotas da amostra tenham desaparecido completamente.
Após dois minutos, repita a entrega até que todo o volume de célula-tronco mesenquimal tenha sido entregue. Em seguida, devolva o mouse à sua gaiola com monitoramento até a completa recumbência. Para acompanhar a migração das células-tronco mesenquimais por ressonância magnética, coloque o rato anestesiado no suporte de imagem do imager MR.
Em seguida, coloque o animal no lugar e mova o suporte para o centro da bobina de ressonância magnética. Defina o tempo de repetição para 1500 milissegundos e o tempo de eco para 2,8 milissegundos. Em seguida, defina o campo de visão para 16 por 16 milímetros, a matriz de aquisição para 128 por 128, e a espessura da fatia para 0,75 por 0,8 milímetros com quatro médias de sinal e um ângulo de 90 graus para adquirir escaneamentos ponderados por estrelas T2 usando uma sequência de echo spin.
Após concluir os exames, retire o suporte do mouse do centro da bobina de ressonância magnética e devolva o mouse à gaiola com monitoramento até a recumbência total. Para rastrear e quantificar as células-tronco mesenquimais rotuladas nas imagens ponderadas por estrelas T2, abra os dados no software de snap de ti e selecione o rótulo ativo. Criar segmentações das áreas de hipointense e da lesão ou outras partes cerebrais de interesse, utilizando diferentes cores de rótulo para cada segmento.
Use a ferramenta polígono na barra principal de ferramentas para selecionar as áreas de hipointense que representam o óxido de ferro super paramagnético rotulado células-tronco mesenquimais e clique em aceitar. As áreas segmentadas aparecerão na mesma cor do rótulo ativo atribuído a esse segmento específico. Quando todas as fatias forem segmentadas, use a ferramenta bisturi para desenvolver um mapa 3D das áreas segmentadas para representar a distribuição de células-tronco mesenquimais em todo o cérebro.
Para realizar uma análise quantitativa da média de volume e intensidade das áreas de hipointense segmentada representando as células rotuladas, clique na segmentação e selecione volume e estatística. 24 horas após a entrega intranasal, o óxido de ferro super paramagnético rotulado células-tronco mesenquimais são detectados como áreas de higpointense forte medial para a lesão cortical em imagens ponderadas estrela T2, indicando a migração direcionada de óxido de ferro super paramagnético para o local da lesão. Esta migração permanece visível até 14 dias após a entrega sem qualquer redução perceptível no sinal.
Os animais feridos tratados com PBS não apresentam áreas de hipointense em nenhum momento, indicando que as áreas de hipointense observadas correspondem ao óxido de ferro super paramagnético rotulado células-tronco mesenquimais, e não são devidos a artefatos de sinal. A bio-distribuição das células-tronco mesenquimais rotuladas pode ser visualizada usando reconstrução 3D, histologicamente por manchas azuis prussianas, ou pela detecção florescence do óxido de ferro super paramagnético marcado fitc dentro das células-tronco mesenquimais rotuladas. Certifique-se de validar os resultados da ressonância magnética com estologia ou outros métodos.
Como partículas super magnéticas de óxido de ferro podem permanecer nos tecidos após a morte da célula, levando a falsos sinais positivos. Após este procedimento, um possível rastreamento temperal não invasivo na quantificação pode ser aplicado para responder perguntas sobre o aprimoramento das habilidades e retenção de células-tronco mesenquimais no cérebro. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da medicina regenerativa explorarem métodos para melhorar o aprimoramento celular para áreas específicas do cérebro.
