Diese Methode kann helfen, die Basisverteilung der lobitischen Stammzelle nach der intranasalen Lieferung an das Gehirn zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die nicht-invasive Lieferung und Verfolgung von mesenchymalen Stammzellen an das Gehirn erleichtert wird. Auch die mehrfachen Dosierungen sind möglich, um die therapeutische Wirkung der transplantierten Zellen im chronischen Stadium nach den Verletzungen zu maximieren.
Diese Technik maximiert die Anzahl der Zellen, die an die Verletzungsstelle geliefert werden, und minimiert das Fortschreiten der lobitischen Zelle in andere Gewebe. Obwohl diese Technik Einblicke in die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen in traumatischen Hirnverletzungstherapien bietet, kann sie auch für die Untersuchung nicht-traumatischer Hirnverletzungen verwendet werden. Für die mesenchymale Stammzellbeschriftung mit superparamagnetischem Eisenoxid sechs Milliliter Etikettierungsmedium zu einer 80%konfluenten mesenchymalen Stammzellkultur in einem T 75 Kolben für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid hinzufügen.
Am nächsten Tag den Supernatanten vorsichtig ansaugen und die Zellen zweimal mit sechs Millilitern PBS pro Waschgang waschen. Um festzustellen, ob die Zellen erfolgreich beschriftet wurden, überprüfen Sie die Kultur unter einem Floreszenzmikroskop. Um eine CCI-Verletzung zu induzieren, nachdem sie einen Mangel an Reaktion auf Pedalreflex bestätigt hat, verwenden Sie elektronische Clipper, um das Fell von der dorsalen Oberfläche des Schädels zu rasieren, und reinigen Sie den rasierten Bereich mehrmals mit einem sterilen Wattestäbchen, der in Jod getränkt ist.
Verwenden Sie einen Wattestäbchen in 70% Ethanol getränkt, um das Jod nach dem letzten Tupfer zu entfernen und das Tier in einen stereotaktischen Rahmen zu legen. Sichern Sie die Maus mit dem Ohr und Nasenstangen und machen Sie einen 2,5 Zentimeter midsagittalen Schnitt in der rasierten Haut, um auf die Oberfläche des Schädels zuzugreifen. Verwenden Sie ein Wattepad, um das Gewebe zu entfernen, das den Schädel bedeckt, und reinigen Sie die Schädeloberfläche für 10 Sekunden mit einem Wattestäbchen, das mit 3% Wasserstoffperoxid getränkt ist.
Trocknen Sie den Schädel mit einem frischen Wattepad und zeichnen Sie mit einem Bleistift einen Vier-Millimeter-Kreis um die Koordinaten der Wahl auf dem freiliegenden Knochen. Mit einem Mikrobohrer mit einem runden Bohrer von 0,5 MillimeterDurchmesser den Schädel am markierten Kreis vorsichtig ausdünnen, ohne Druck auszuüben. Entfernen Sie Knochenstaub mit einem sauberen und trockenen Wattestäbchen und verwenden Sie sterile, eingelegte Zangen, um die resultierende Knochenklappe sorgfältig zu entfernen.
Wenn die Dura mater freigelegt wurde, übertragen Sie die Maus in den stereotaktischen Rahmen des CCI-Geräts und sichern Sie das Tier mit den Ohr- und Nasenstangen, so dass der Kopf in rostrocaudaler Richtung eben ist. Wenn Sie den Anweisungen im Steuerkasten folgen, wird die Stoßspitze mit den X- und Y-Steuerrädern auf der Basis des Stoßators auf Null der Schlagspitze gebracht, um die Stoßspitze direkt über den gewünschten Kortexkoordinaten auszurichten. Verwenden Sie das Steuerfeld, um die Experimentparameter auf eine Geschwindigkeit von fünf Metern pro Sekunde, eine Verweilzeit von 250 Millisekunden und eine Verletzungstiefe von einem Millimeter festzulegen, um eine leichte Verletzung auszulösen.
Drücken Sie dann die Schlagtaste auf dem Steuerfeld. Wischen Sie alle Blutungen, die mit einem sterilen Wattestäbchen auftreten, und entfernen Sie die Maus aus dem Rahmen. Schließen Sie den Schnitt mit Seidenchirurgischen Nähten und wenden Sie topische Antibiotika auf die Stelle an, bevor Sie die Maus auf ein Heizkissen mit Überwachung bis zur vollständigen Resüpperität legen.
Behandeln Sie einen Tag nach der Verletzung das superparamagnetische Eisenoxid, das als mesenchymale Stammzellkultur bezeichnet wird, mit drei Millilitern Trypsin. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius beginnen Sie die Reaktion mit sieben Millilitern vorgewärmten DMEM-Mediums, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum und sammeln Die Zellsuspension in einem 15 Milliliter konischen Rohr. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in PBS zum Zählen wieder auf.
Passen Sie dann die Zellkonzentration auf 1,5 mal 10 auf die fünf Zellen pro 18 Mikroliter PBS an. Für die Zellabgabe, nach der Bestätigung der fehlenden Reaktion auf Zehenkneifung, scruff die Maus während der Immobilisierung des Schädels. Legen Sie die Spitze einer Pipette mit vier Einheiten Hyaluronidase pro Mikroliter PBS in der Nähe des Mauswinkels in einem 45-Grad-Winkel und verabreichen Sie drei Mikroliter Hyaluronidasesuspension in jedes Nasenloch.
Legen Sie das Tier fünf Minuten lang auf ein sauberes Pad, bevor Sie die Behandlung viermal für insgesamt 100 Einheiten Hyaluronidase-Behandlung wiederholen. Legen Sie die Maus nach der letzten Behandlung für 30 Minuten wieder auf das Pad, bevor Sie die Maus zurückhalten, wie gerade gezeigt. Mit dem Kopf immobilisiert, verabreichen Sie drei Mikroliter der mesenchymalen Stammzellsuspension in jedes Nasenloch über einen Zeitraum von drei Sekunden pro Lösungsabgabe, wobei die Maus 30 Sekunden in Position gehalten wird, bis die Probentropfen vollständig verschwunden sind.
Wiederholen Sie die Lieferung nach zwei Minuten bis zu dreimal, bis das gesamte Volumen der mesenchymalen Stammzelle geliefert ist. Dann kehren Sie die Maus in ihren Käfig mit Überwachung, bis volle Recumbency. Um die Migration der mesenchymalen Stammzellen mittels MRT zu verfolgen, legen Sie die anästhesierte Maus auf den bildgebenden Halter des MR-Imagers.
Dann sichern Sie das Tier an Ort und Stelle und bewegen Sie den Halter in die Mitte der MRT-Spule. Stellen Sie die Wiederholungszeit auf 1500 Millisekunden und die Echozeit auf 2,8 Millisekunden ein. Legen Sie dann das Sichtfeld auf 16 mal 16 Millimeter, die Erfassungsmatrix auf 128 mal 128 und die Scheibendicke mit vier Signaldurchschnitten und einem 90-Grad-Flip-Winkel auf 0,75 mal 0,8 Millimeter fest, um T2-Sterngewichtete Scans mithilfe einer Spin-Echo-Sequenz zu erfassen.
Nach Abschluss der Scans ziehen Sie den Maushalter aus dem MRT-Spulenzentrum zurück und geben Sie die Maus mit Überwachung in ihren Käfig zurück, bis sie vollständig zurückgezogen ist. Um die beschrifteten mesenchymalen Stammzellen auf den gewichteten T2-Sternbildern zu verfolgen und zu quantifizieren, öffnen Sie die Daten in der IT-Fall-Snap-Software und wählen Sie ein aktives Etikett aus. Um Segmentierungen der hypointense Bereiche und der Läsion oder andere Gehirnteile von Interesse zu erstellen, mit unterschiedlichen Beschriftungsfarben für jedes Segment.
Verwenden Sie das Polygonwerkzeug in der Hauptwerkzeugleiste, um die hypointenseNbereiche auszuwählen, die die superparamagnetischen Eisenoxide mit der Bezeichnung mesenchymale Stammzellen darstellen, und klicken Sie auf Akzeptieren. Die segmentierten Bereiche werden in derselben Farbe wie die aktive Beschriftung angezeigt, die diesem Segment zugewiesen ist. Wenn alle Slices segmentiert sind, verwenden Sie das Skalpellwerkzeug, um eine 3D-Karte der segmentierten Bereiche zu entwickeln, um die mesenchymale Stammzellverteilung im gesamten Gehirn darzustellen.
Um eine quantitative Analyse des Volumen- und Intensitätsmittels der segmentierten hypointense-Bereiche durchzuführen, die die beschrifteten Zellen darstellen, klicken Sie auf Segmentierung, und wählen Sie Volumen und Statistiken aus. 24 Stunden nach der intranasalen Lieferung werden superparamagnetische Eisenoxide mit der Bezeichnung mesenchymale Stammzellen als starke hypointense Bereiche medial zur kortikalen Verletzung auf T2-Stern gewichteten Bildern nachgewiesen, was auf die gezielte Migration von superparamagnetischem Eisenoxid an die Verletzungsstelle hindeutet. Diese Migration bleibt bis zu 14 Tage nach der Lieferung sichtbar, ohne dass das Signal spürbar reduziert wird.
Verletzte Tiere, die mit PBS behandelt werden, weisen zu keinem Zeitpunkt hypointensive Bereiche auf, was darauf hindeutet, dass die beobachteten hypointense-Bereiche den superparamagnetischen Eisenoxid-markierten mesenchymalen Stammzellen entsprechen und nicht auf Signalartefakte zurückzuführen sind. Die Bioverteilung der beschrifteten mesenchymalen Stammzellen kann mittels 3D-Rekonstruktion, histologisch durch preußische Blaufärbung oder durch Blütenstichdetektion von FITC mit superparamagnetischem Eisenoxid in den beschrifteten mesenchymalen Stammzellen visualisiert werden. Überprüfen Sie die MRT-Ergebnisse mit Esthologie oder anderen Methoden.
Da supermagnetische Eisenoxidpartikel nach dem Absterben der Zelle im Gewebe verbleiben können, was zu falschen positiven Signalen führt. Nach diesem Verfahren kann eine mögliche temperale nicht-invasive Nachverfolgung in der Quantifizierung angewendet werden, um Fragen bezüglich der Entwicklung der Fähigkeiten und der Retention von mesenchymalen Stammzellen im Gehirn zu beantworten. Nach dieser Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der regenerativen Medizin geebnet, um Methoden zur Verbesserung der Zellhonung auf bestimmte Bereiche des Gehirns zu erforschen.
