이 방법은 뇌에 비강 내 전달다음 로비줄기 세포의 기본 분포를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 뇌에 비 침습적 인 전달 및 중간 엽 줄기 세포의 추적을 용이하게한다는 것입니다. 또한, 다중 투여량은 부상 후 만성 단계에서 이식된 세포의 치료 효과를 극대화할 수 있다.
이 기술은 부상 부위에 전달되는 세포의 수를 최대화하고 다른 조직으로 의 로비티세포의 진행을 최소화합니다. 이 기술은 외상성 뇌 손상 치료에 중간 엽 줄기 세포의 사용에 대 한 통찰력을 제공 하지만, 그것은 또한 비 외상성 뇌 손상의 조사에 사용할 수 있습니다. 초파라자성 철산화로 라벨링하는 중간엽 줄기 세포 라벨링의 경우, T 75 플라스크에 80%의 응우성 중간엽 줄기 세포 배양에 라벨링 배지 6밀리리터를 추가하여 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 배양에 대한다.
다음 날, 조심스럽게 슈퍼 나탄을 흡인하고 세척 당 PBS의 여섯 밀리리터와 함께 세포를 두 번 세척. 세포가 성공적으로 표지되었는지 확인하려면, 식물성 현미경의 밑에 배양을 확인하십시오. CCI 손상을 유도하기 위해, 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 두개골의 등대 표면에서 모피를 면도전자 클리퍼를 사용하고, 요오드에 담근 멸균 면봉으로 면도 영역을 여러 번 청소하십시오.
70%에탄올에 담근 면봉을 사용하여 마지막 면봉 후 요오드를 제거하고 동물을 스테레오데스트 프레임에 넣습니다. 귀와 코 막대로 마우스를 고정하고 두개골 표면에 액세스하기 위해 면도 된 피부에 2.5 센티미터 중간 절개를합니다. 면 패드를 사용하여 두개골을 덮는 조직을 제거하고 과산화수소 3 %로 담근 면봉으로 두개골 표면을 10 초 동안 청소하십시오.
신선한 면 패드로 두개골을 말리고 연필을 사용하여 노출된 뼈에 선택한 좌표 주위에 4밀리미터 원을 그립니다. 0.5밀리미터 직경의 둥근 버가 장착된 마이크로 드릴을 사용하여 압력을 가하지 않고 표시된 원에서 두개골을 조심스럽게 얇게 만듭니다. 깨끗하고 건조한 면봉으로 뼈 먼지를 제거하고 멸균 처리 된 집게를 사용하여 결과 뼈 플랩을 조심스럽게 제거하십시오.
듀라 메이트가 노출되면, CCI 장치의 스테레오전술 프레임으로 마우스를 옮기고, 머리가 로스트로코골 방향으로 레벨이 되도록 귀와 코 막대로 동물을 고정한다. 컨트롤 박스의 지침에 따라, 영향을 받을 원하는 피질 좌표 바로 위에 임펙터 팁을 정렬하기 위해 임펙터의 베이스에 X 및 Y 제어 휠을 사용하여 노출 된 피질 표면에 충격기 팁을 제로. 제어 상자를 사용하여 실험 매개 변수를 초당 5미터의 속도, 250밀리초의 거주 시간 및 1밀리미터의 부상 깊이로 설정하여 경미한 부상을 유도합니다.
그런 다음 컨트롤 박스의 충격 버튼을 누릅니다. 멸균 면봉으로 발생하는 출혈을 면봉하고 프레임에서 마우스를 제거합니다. 실크 수술 봉합사절을 닫고 전체 재림까지 모니터링과 가열 패드에 마우스를 배치하기 전에 사이트에 국소 항생제를 적용합니다.
부상 후 하루, 트립신의 3 밀리리터와 함께 중간엽 줄기 세포 배양표시 슈퍼 paramagnetic 철 산화물을 치료. 섭씨 37도에서 5분 후, 10%의 태아 소 혈청으로 보충된 7밀리리터의 전동DMEM 배지로 반응을 시작하고 세포 현탁액을 15밀리리터 원추형 튜브로 수집합니다. 세포를 원심분리에 의한 퇴적물을 계산하기 위해 PBS에서 펠릿을 다시 중단한다.
이어서, PBS의 18마이크로리터당 5개의 세포에 세포 농도를 1.5배 10배로 조절한다. 세포 전달의 경우 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후 두개골을 고정하면서 마우스를 스크러프합니다. 45도 각도로 마우스의 나레 근처에 PBS의 마이크로리터 당 히알루로니다아제 4 단위를 포함하는 파이펫의 끝을 놓고 각 콧구멍에 히알루로니다제 현탁액 의 3 마이크로 리터를 투여합니다.
동물얼굴을 깨끗한 패드에 5분간 올려 놓고 총 100단위의 히알루로니다제 치료를 위해 치료를 네 번 반복합니다. 마지막 치료 후, 마우스를 패드에 다시 30 분 동안 놓고 마우스를 방금 시연한 대로 억제합니다. 헤드가 고정되어, 용액 전달당 3초 동안 각 콧구멍에 중간엽 줄기 세포 현탁액의 3마이크로리터를 투여하고, 샘플 방울이 완전히 사라질 때까지 마우스를 30초 동안 제자리에 고정시한다.
2분 후, 중간엽 줄기세포의 전체 부피가 전달될 때까지 최대 3회까지 전달을 반복한다. 그런 다음 마우스를 전체 재조정이 있을 때까지 모니터링하여 케이지에 반환합니다. MRI에 의한 중간엽 줄기 세포의 이동을 추적하려면 마취된 마우스를 MR 이미저의 이미징 홀더에 놓습니다.
그런 다음 동물을 제자리에 고정시키고 홀더를 MRI 코일의 중심으로 이동시합니다. 반복 시간을 1500밀리초로 설정하고 에코 시간을 2.8밀리초로 설정합니다. 이어서, 시야를 16x 16mm로 설정하고, 획득 매트릭스는 128x 128로, 슬라이스 두께는 0.75 x 0.8 밀리미터로 4개의 신호 평균과 90도 플립 각도로 스핀 에코 서열을 이용하여 T2 스타 가중치 스캔을 획득한다.
스캔을 완료한 후 MRI 코일 센터에서 마우스 홀더를 철회하고 마우스를 전체 재조정이 있을 때까지 모니터링하여 케이지로 되돌리게 됩니다. T2 별 가중치 이미지에서 표지된 중간엽 줄기 세포를 추적하고 정량화하려면 IT 케이스 스냅 소프트웨어의 데이터를 열고 활성 라벨을 선택합니다. 각 세그먼트에 대해 서로 다른 레이블 색상을 사용하여 저층 영역과 병변 또는 기타 뇌 부분의 세분화를 만듭니다.
메인 도구 모음의 다각형 도구를 사용하여 중간엽 줄기 세포로 표시된 초파라자성 철산화물을 나타내는 저중농도 영역을 선택하고 수락을 클릭합니다. 분할된 영역은 해당 특정 세그먼트에 할당된 활성 레이블과 동일한 색상으로 표시됩니다. 모든 슬라이스가 분할된 경우 메스 도구를 사용하여 분할된 영역의 3D 맵을 개발하여 전체 뇌의 중간엽 줄기 세포 분포를 나타냅니다.
레이블이 부착된 셀을 나타내는 세분화된 저강도 영역의 부피 및 강도 평균에 대한 정량적 분석을 수행하려면 세분화를 클릭하고 볼륨 및 통계를 선택합니다. 비강 내 전달 후 24시간 후, 중증기철 산화물이 부착된 중화줄기세포는 T2 스타 가중 이미지상피질 손상내진부위로 강한 저중농도로 검출되어 상해 부위로 초파라자성 철산화물의 표적 이동을 나타낸다. 이 마이그레이션은 신호가 눈에 띄지 않게 감소하지 않고 배달 후 최대 14일까지 유지됩니다.
PBS로 치료된 부상당한 동물은 언제든지 저중농도 부위를 나타내지 않으며, 관찰된 저중농도 부위가 중화줄기 세포로 표시된 초파라자성 철산화물에 해당하며 신호 아티팩트 때문이 아님을 나타냅니다. 표지된 중간엽 줄기 세포의 생체 분포는 3D 재구성, 프로이센 블루 염색에 의한 조직학적, 또는 FITC태그가 지정된 중간엽 줄기 세포 내에서 FITC 태그슈퍼 파라자성 산화물의 플로레스션 검출에 의해 시각화될 수 있다. ESthology 또는 기타 방법으로 MRI 결과를 검증해야 합니다.
초자기 철 산화 입자는 세포가 죽은 후 조직에 남아있을 수 있기 때문에 거짓 양성 신호로 이어질 수 있습니다. 이 절차에 따라, 가능한 템퍼럴 비 침습적 추적 정량화에서 뇌의 중간 엽 줄기 세포의 능력과 보존을 연마에 관한 질문에 대답하기 위해 적용 될 수있다. 이 개발 후,이 기술은 뇌의 특정 영역에 세포 연마를 개선하기위한 방법을 탐구하는 재생 의학 분야에서 연구원을위한 길을 열었습니다.
