Este método puede ayudar a determinar la distribución base de la célula madre lobótica después de la administración intranasal al cerebro. La principal ventaja de esta técnica es que facilita la entrega no invasiva y el seguimiento de las células madre mesenquimales al cerebro. También, las dosis múltiples son posibles para maximizar los efectos terapéuticos de las células trasplantadas en la etapa crónica después de las lesiones.
Esta técnica maximiza el número de células entregadas al sitio de la lesión y minimiza la progresión de la célula lobótica en otros tejidos. Aunque esta técnica proporciona información sobre el uso de células madre mesenquimales en terapias de lesiones cerebrales traumáticas, también se puede utilizar para la investigación de lesiones cerebrales no traumáticas. Para el etiquetado de células madre mesenquimales con óxido de hierro super paramagnético, agregue seis mililitros de medio de etiquetado a un cultivo de células madre mesenquimales 80%confluentes en un matraz T 75 para una incubación de 24 horas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
Al día siguiente, aspirar cuidadosamente el súper natant y lavar las células dos veces con seis mililitros de PBS por lavado. Para determinar si las células han sido etiquetadas con éxito, compruebe el cultivo bajo un microscopio florescente. Para inducir una lesión de CCI, después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, utilice cortadoras electrónicas para afeitar el pelaje de la superficie dorsal del cráneo, y limpie el área afeitada varias veces con un hisopo de algodón estéril empapado en yodo.
Use un hisopo de algodón empapado en 70% de etanol para eliminar el yodo después del último hisopo y colocar el animal en un marco estereotáctico. Asegure el ratón con las barras de la oreja y la nariz y haga una incisión midsagittal de 2,5 centímetros en la piel afeitada para acceder a la superficie del cráneo. Usa una almohadilla de algodón para eliminar el tejido que cubre el cráneo y limpiar la superficie del cráneo durante 10 segundos con un hisopo de algodón empapado con 3% de peróxido de hidrógeno.
Seque el cráneo con una almohadilla de algodón fresco y use un lápiz para dibujar un círculo de cuatro milímetros alrededor de las coordenadas de elección en el hueso expuesto. Usando un micro taladro equipado con una fresa redonda de 0,5 milímetros de diámetro, adelgaza cuidadosamente el cráneo en el círculo marcado sin aplicar presión. Retire cualquier polvo óseo con un hisopo de algodón limpio y seco y use fórceps archivados estériles para eliminar cuidadosamente la solapa ósea resultante.
Cuando el dura mater haya sido expuesto, transfiera el ratón al marco estereotáctico del dispositivo CCI, y asegure el animal con las barras de oreja y nariz para que la cabeza esté nivelada en la dirección rostrocaudal. Siguiendo las instrucciones de la caja de control, cero la punta del impactador a la superficie cortical expuesta utilizando las ruedas de control X e Y en la base del impactador para alinear la punta del impactador directamente por encima de las coordenadas de la corteza deseadas para ser afectada. Utilice el cuadro de control para establecer los parámetros del experimento a una velocidad de cinco metros por segundo, un tiempo de permanencia de 250 milisegundos y una profundidad de lesión de un milímetro para inducir una lesión leve.
A continuación, pulse el botón de impacto en el cuadro de control. Swab cualquier sangrado que se produce con un hisopo de algodón estéril y retire el ratón del marco. Cierre la incisión con suturas quirúrgicas de seda y aplique antibióticos tópicos en el sitio antes de colocar el ratón sobre una almohadilla de calentamiento con monitoreo hasta la recumbancia completa.
Un día después de la lesión, tratar el óxido de hierro súper paramagnético etiquetado mesenquimal cultivo de células madre con tres mililitros de trippsina. Después de cinco minutos a 37 grados centígrados, comience la reacción con siete mililitros de medio DMEM precalentó, complementado con un suero bovino 10%fetal y recoja la suspensión celular en un tubo cónico de 15 mililitros. Sedimentar las células por centrifugación y volver a suspender el pellet en PBS para el recuento.
Luego, ajuste la concentración celular a 1.5 veces 10 a las cinco células por cada 18 microlitros de PBS. Para la administración celular, después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del otro, rasga el ratón mientras inmoviliza el cráneo. Coloque la punta de una pipeta que contenga cuatro unidades de hialuronidasa por microlitro de PBS cerca de la nare del ratón en un ángulo de 45 grados, y administre tres microlitros de suspensión de hialuronidasa en cada fosa nasal.
Coloque el animal boca arriba en una almohadilla limpia durante cinco minutos antes de repetir el tratamiento cuatro veces para un total de 100 unidades de tratamiento con hialuronidasa. Después del último tratamiento, vuelva a colocar el ratón en la almohadilla durante 30 minutos, antes de restringir el ratón como se acaba de demostrar. Con la cabeza inmovilizada, administre tres microlitros de la suspensión de células madre mesenquimales en cada fosa nasal durante un período de tres segundos por entrega de la solución, manteniendo el ratón en su posición durante 30 segundos hasta que la muestra haya desaparecido por completo.
Después de dos minutos, repita el parto hasta tres veces hasta que se haya entregado todo el volumen de células madre mesenquimales. A continuación, vuelva el ratón a su jaula con supervisión hasta la recumbencia completa. Para realizar un seguimiento de la migración de las células madre mesenquimales por RMN, coloque el ratón anestesiado en el soporte de imagen del imager de RM.
A continuación, fije el animal en su lugar y mueva el soporte al centro de la bobina de RMN. Establezca el tiempo de repetición en 1500 milisegundos y el tiempo de eco en 2,8 milisegundos. A continuación, establezca el campo de visión en 16 por 16 milímetros, la matriz de adquisición en 128 por 128, y el grosor de la rebanada en 0,75 por 0,8 milímetros con cuatro promedios de señal y un ángulo de volteo de 90 grados para adquirir escaneos ponderados de estrella T2 utilizando una secuencia de eco de giro.
Después de completar los escaneos, retraiga el soporte del ratón del centro de la bobina de RMN y devuelva el ratón a su jaula con monitoreo hasta la recumbencia completa. Para realizar un seguimiento y cuantificar las células madre mesenquimales etiquetadas en las imágenes ponderadas por estrellas T2, abra los datos en el software de ajuste de casos de TI y seleccione la etiqueta activa. Crear segmentaciones de las áreas de hypointense y la lesión u otras partes del cerebro de interés, utilizando diferentes colores de etiqueta para cada segmento.
Utilice la herramienta poligonal de la barra de herramientas principal para seleccionar las áreas de hypointense que representan el óxido de hierro super paramagnético etiquetado como células madre mesenquimales y haga clic en Aceptar. Las áreas segmentadas aparecerán en el mismo color que la etiqueta activa asignada a ese segmento en particular. Cuando todas las rebanadas se hayan segmentado, utilice la herramienta de bisturí para desarrollar un mapa 3D de las áreas segmentadas para representar la distribución de células madre mesenquimales en todo el cerebro.
Para realizar un análisis cuantitativo de la media de volumen e intensidad de las áreas de hipointso segmentadas que representan las celdas etiquetadas, haga clic en segmentación y seleccione volumen y estadísticas. 24 horas después de la administración intranasal, el óxido de hierro super paramagnético etiquetado células madre mesenquimales se detectan como áreas hipointenses fuertes mediales a la lesión cortical en imágenes ponderadas por estrellas T2, lo que indica la migración dirigida de óxido de hierro super paramagnético al sitio de la lesión. Esta migración permanece visible hasta 14 días después de la entrega sin ninguna reducción notable de la señal.
Los animales lesionados tratados con PBS no presentan áreas de hipointsia en ningún momento, lo que indica que las áreas de hypointense observadas corresponden a las células madre mesenquimales con óxido de hierro súper paramagnético, y no se deben a artefactos de señal. La biodispación de las células madre mesenquimales etiquetadas se puede visualizar mediante la reconstrucción 3D, histológicamente por tinción azul prusiana, o mediante la detección de florescencia de óxido de hierro super paramagnético etiquetado con etiquetas dentro de las células madre mesenquimales etiquetadas. Asegúrese de validar los resultados de la RMN con estología u otros métodos.
Como las partículas de óxido de hierro súper magnético pueden permanecer en los tejidos después de que la célula muere, lo que conduce a señales falsas positivas. Después de este procedimiento, se puede aplicar un posible seguimiento templado no invasivo en la cuantificación para responder preguntas sobre cómo perfeccionar las capacidades y la retención de células madre mesenquimales en el cerebro. Después de este desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la medicina regenerativa exploren métodos para mejorar el perfeccionamiento celular en áreas específicas del cerebro.
