يسمح هذا البروتوكول CSF وجمع الدم في التصحيح الكمي لمستويات بروتين CSF لقياس في تخليق البروتين الهسال في نماذج الماوس من الاضطرابات العصبية. يوفر هذا الإجراء خط أساس، والذي ضد المنشأ الفسيولوجية لبروتينات CSF ذات الاهتمام، والاستقرار والأهمية الوظيفية للدم CSF صالح السلامة يمكن تقييمها. يمكن تطبيق تحليل تخليق البروتين البيني وسلامة الحاجز على نماذج حيوانية ودراسات بشرية أخرى.
على سبيل المثال ، للتحقق من أمراض الجهاز العصبي المركزي. جمع كميات كبيرة من CSF نظيفة يمكن أن يكون تحديا من الناحية الفنية في الفئران، لذلك ممارسة هذه التقنية حتى كميات كبيرة من العينة غير ملوثة ينصح. سيكون إظهار الإجراءات هو مايكل لينزي، وهو طالب غراد من البرنامج في الطب التجريبي والجزيئي في دارتموث، في مجموعتنا الجديدة لأبحاث المناعة.
لجمع المصل عن طريق النزيف المداري الرجعية. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لدواسة منعكس في أكثر من 15 غرام الماوس تخدير، فهم الجلد فضفاضة وراء الأذنين مع الإبهام وسببة اليد غير المهيمنة، واستخدام السبابة لرسم مرة أخرى الجلد فوق العينين. باستخدام الإبهام لرسم الجلد مرة أخرى تحت العينين، ضع طرف ماصة باستير، التي عقدت بزاوية 45 درجة تقريبا، في مقبس العين تحت مقلة العين، موجهة نحو منتصف مقبس العين، في حين تناوب الماصة بين الأصابع.
ثم تطبيق ضغط قصير ولطيف وإطلاق سراح للسماح للدم بالدخول إلى ماصة. عندما يتم جمع عينة الدم، قم بإزالة الشعيرات الدموية بلطف دون إصابة العين، ونقل الدم إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر. بعد إغلاق الجفن، ضع ضغطًا خفيفًا مع الشاش لمنع حدوث المزيد من النزيف.
السماح للدم أن تجلط لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الغزل أسفل العينة عن طريق الطرد المركزي. باستخدام تقنية ماصة نظيفة، وجمع المصل المنفصل في قارورة جديدة، وصفت 500 ميكرولتر، وتجميد المصل على الفور في 80 درجة مئوية. بعد التأكد من عدم الاستجابة لردود الفعل دواسة، وإزالة مساحة كبيرة بما يكفي من الشعر للسماح لجمع السائل الشوكي الدماغي على الفور في نهاية السد من الجمجمة من الماوس تخدير.
ضع الماوس في وضع عرضة على جهاز مُجسم في ظروف معقمة، واثبت الرأس بقضبان الأذن. مسحة الموقع الجراحي مع diacetate chlorhexidine 30٪، وجعل شق الجلد القوس أدنى من القذال لفضح العضلات الإفراط في magna cisterna. باستخدام ملقط، وتشريح حادة الأنسجة تحت الجلد والعضلات، واستخدام الداورسات الصغرى لعقد العضلات وبصرف النظر لفضح طبقة ماتر دورا على ماغنا cisterna.
غسل بلطف الأنسجة مع برنامج تلفزيوني معقمة لإزالة أي تلوث ممكن في الدم، واستخدام مسحة القطن العقيمة للطخة الجافة ماتر دورا. إن وضع الثقب الأولي في ماغنا سيستيرنا ضروري للحصول على الوفرة والرافة غير الملوثة. باستخدام إبرة قياس 30، ثقب بلطف الغشاء الذي يغطي ماغنا سيستيرنا، وبسرعة وبلطف إدراج أنبوب صغير الشعرية الزجاجية في ثقب.
عندما تم جمع خمسة إلى 12 ميكرولترات من CSF، قم بإزالة الأنبوب بعناية من الغشاء واستخدم قطعة من أنابيب البولي إيثيلين لتوصيل الأنبوب بحقنة ثلاثة ملليلتر. حقن CSF التي تم جمعها في أنبوب 500 ميكرولتر المسمى على الجليد، واستخدام إبرة المتاح وخيوط البولي ديوكسانون متنوعة لإغلاق شق. تنظيف المنطقة من أي دم المجففة أو الأنسجة، ووضع الماوس في قفص نظيفة، دافئ مع مراقبة حتى إعادة شغل كامل.
جمع CSF عن طريق الطرد المركزي، وفحص بصريا بيليه وsupernate أنه لأي علامات على تلوث الدم. ثم باستخدام تقنية ماصة نظيفة، ونقل عظمى التي تحتوي على CSF إلى أنبوب 200 ميكرولتر جديد، وتمييع CSF بنسبة واحد إلى ثلاثة مع برنامج تلفزيوني لتخزين فوري في 80 درجة مئوية. لجمع المصل عن طريق ثقب القلب، مباشرة بعد جمع CSF، كما أظهرت للتو، وضع الماوس في موقف supine.
مسحة الجلد البطني مع 70٪ الكحول. استخدم المقص لفتح تجويف الصدر، مما يعرض القلب، وأدخل إبرة قياس 25 تعلق على حقنة 3 ملليلتر في البطين الأيسر. ثم تطبيق بلطف الضغط السلبي على المكبس حقنة، وسحب الإبرة بعد أن تم جمع الدم.
اِكتِل المُغطّى لإخراج الدم المجمّع في قارورة 1.5 مليلتر. الآن، السماح للدم أن يتخثر لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل فصل المصل عن طريق الطرد المركزي. ثم، باستخدام تقنية ماصة نظيفة، نقل المصل إلى قارورة جديدة تسمى 500 ميكرولتر لتخزين فوري في 80 درجة مئوية.
لتحديد كمية البروتينات المستهدفة والزوالب في عينات مصل متطابقة و CSF، استخدم مقايسة كمية البروتين القياسية القياسية، وذلك باستخدام البروتينات القياسية المشار إليها لإعداد منحنى قياسي لكل بروتين من البروتينات ذات الاهتمام. بعد التحليل، تصدير البيانات الخام إلى برنامج الرسم البياني البرامج المناسبة، والرسم البياني الكشف عن كثافة fluorescence مقارنة بتركيزات البروتين القياسية لإنشاء منحنى قياسي لكل بروتين من الفائدة. ثم استخدم المنحنيات القياسية لحساب تركيزات كل تحليل من الاهتمام في العينات.
وأخيراً، استخدمي الزّومات و استهدفي تركيزات التحليلات لحساب قيم Q وفهرس داخل الـ.. المستويات الفعلية لمجموع IgG هي زيادة كبيرة في CSF من اثنين من نماذج القوارض اختبار التصلب المتعدد، بالمقارنة مع العمر المقابلة الضوابط صورية مطابقة. تظهر فئران R-EAE قيم حاصلة معززة بشكل كبير، مما يشير إلى زيادة نفاذية حاجز الدم في الدماغ في هذه الفئران.
Nonverversely ، لا توجد اختلافات في حاصل الألبومات بين TMEV - IDD والفئران الشام ، مما يؤكد النتائج السابقة لحاجز سليم في الفئران TMEV - IDD. وبالإضافة إلى ذلك، في الحيوانات TMEV-IDD، أعلى بكثير من قيم مؤشر IgG، وبالتالي، لوحظ إنتاج داخل IgG داخل. وييسر حساب مؤشر البروتين تحديد المؤشرات الحيوية البروتينية الجديدة المفيدة للتشخيص المبكر، والتنبؤ بالنتيجة، ورصد مسار المرض لكل من الأمراض العصبية العصبية والعصبية.
