이 프로토콜은 CSF 단백질 수준의 정량적 교정에서 CSF 및 혈액 수집이 신경 장애의 마우스 모델에서 단백질 합성으로 측정할 수 있게 합니다. 이 절차는 CSF 단백질의 병리학적 기원이 관심있는 기준을 제공하고, 혈액 CSF호의 안정성 및 기능적 중요성을 평가할 수 있다. 인터테칼 단백질 합성 및 장벽 무결성분석은 다른 동물 모델 및 인간 연구에 적용될 수 있다.
예를 들어 중추 신경계의 질병을 확인하십시오. 상당한 양의 깨끗한 CSF를 수집하는 것은 마우스에서 기술적으로 어려울 수 있으므로 오염되지 않은 시료의 대량이 얻을 수 있을 때까지 기술을 연습하는 것이 좋습니다. 절차를 보여주는 것은 우리의 새로운 면역학 연구 단에 있는 다트머스에 있는 실험과 분자 의학에 있는 프로그램에서 대학원 학생인 미셸 린지, 일것입니다.
복고풍 궤도 출혈을 통해 혈청 수집. 15그램 이상의 마취 마우스에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 엄지손가락과 집게 손가락으로 귀 뒤쪽의 느슨한 피부를 잡고 검지 손가락을 사용하여 눈 위에 피부를 다시 그립니다. 엄지 손가락을 사용하여 눈 아래 피부를 다시 그릴 수 있으며, 약 45도 각도로 유지되는 파스퇴르 파이펫의 끝을 눈알 아래 의안 소켓에 놓고 손가락 사이에 파이펫을 회전시합니다.
그런 다음 짧고 부드러운 압력을 가하고 혈액이 파이펫에 들어갈 수 있도록 방출합니다. 혈액 샘플을 채취하면 눈을 손상시키지 않고 모세관을 부드럽게 제거하고 혈액을 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 눈꺼풀을 닫은 후, 더 이상의 출혈을 방지하기 위해 거즈로 가벼운 압력을 가하십시오.
원심분리에 의해 시료를 아래로 회전하기 전에 실온에서 30-60 분 동안 혈액응고를 허용합니다. 깨끗한 파이펫 기술을 사용하여 분리된 세럼을 500 마이크로리터 바이알로 새 혈청을 수집하고 즉시 섭씨 80도에서 혈청을 동결합니다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 마취 마우스의 두개골의 caudal 끝에 즉시 뇌 척수액의 수집을 허용하기 위해 머리의 큰 영역을 제거합니다.
멸균 조건하에서 입체 장치에 마우스를 배치하고 이어 바으로 머리를 안정시하십시오. 30%클로르헤시딘이 변조하여 수술 부위를 면봉하고, 시스테나 마그나위에 겹쳐진 근육을 노출시키기 위해 산소에 열등한 시상 피부 절개를 합니다. 집게를 사용하여, 무딘 피하 조직과 근육을 해부하고, 떨어져 심폐 소동 마그나 위에 dura mater 수막 층을 노출하기 위해 근육을 개최 마이크로 re트랙터를 사용합니다.
멸균 PBS로 조직을 부드럽게 씻고 가능한 혈액 오염을 제거하고 멸균 면봉을 사용하여 듀라 마터건조를 얼룩질 수 있습니다. 시스테나 마그나에 초기 구멍을 배치하는 것은 풍부하고 오염되지 않은 CSF를 얻는 데 필수적입니다. 30 게이지 바늘을 사용하여, 부드럽게 시스테나 마그나를 덮고 멤브레인을 펑크, 신속하고 부드럽게 펑크에 작은 유리 모세관 튜브를 삽입.
CSF의 5~12마이크로리터가 수집되면, 조심스럽게 멤브레인에서 튜브를 제거하고 3 밀리리터 주사기에 튜브를 연결하는 폴리에틸렌 튜브 의 조각을 사용합니다. 수집된 CSF를 얼음 위에 500 마이크로리터 튜브에 주입하고 일회용 바늘과 다양한 폴리디옥사논 봉합사를 사용하여 절개를 닫습니다. 말린 혈액이나 조직의 영역을 청소하고, 전체 recumncy까지 모니터링깨끗하고 따뜻한 케이지에 마우스를 배치합니다.
원심분리로 CSF를 수집하고, 시각적으로 펠릿을 검사하고 혈액 오염의 징후를 위해 그것을 초장한다. 그런 다음 클린 파이펫 기술을 사용하여 CSF 함유 슈퍼네이트를 새로운 200 마이크로리터 튜브로 전송하고, CSF를 PBS와 1~3비율로 희석하여 섭씨 80도에서 즉각적인 저장을 한다. 심장 천자에 의한 혈청 수집을 위해 CSF 수집 직후, 방금 입증된 것처럼 마우스를 supine 위치에 놓습니다.
70%의 알코올로 복부 피부를 면봉하십시오. 가위를 사용하여 흉부 구멍을 열고 심장을 노출시키고 왼쪽 심실에 3 밀리리터 주사기에 부착된 25 게이지 바늘을 삽입합니다. 그런 다음 주사기 플런저에 부정적인 압력을 부드럽게 적용하여 혈액을 채취한 후 바늘을 철회합니다.
플런저를 우울하게 하여 수집된 혈액을 1.5 밀리리터 바이알로 배출합니다. 이제 혈전을 실온에서 30~60분 동안 응고한 후 혈청을 원심분리로 분리합니다. 그런 다음 깨끗한 파이펫 기술을 사용하여 혈청을 500 마이크로리터 바이알로 전송하여 섭씨 80도에서 즉시 보관합니다.
일치하는 혈청 및 CSF 표본에서 표적 단백질과 알부민을 정량화하려면, 참조된 표준 단백질을 사용하여 관심 있는 각 단백질에 대한 표준 곡선을 준비하는 표준 단백질 정량화 분석서를 사용합니다. 분석 후, 원시 데이터를 적절한 소프트웨어 그래프 프로그램으로 내보내고, 검출 신호 형광 강도를 표준 단백질 농도에 비교하여 관심 있는 각 단백질에 대한 표준 곡선을 생성한다. 그런 다음 표준 곡선을 사용하여 샘플에 대한 관심있는 각 별표의 농도를 계산합니다.
마지막으로 알부민을 사용하여 분석 농도를 대상으로 Q 값과 인트라테칼 인덱스를 계산합니다. 총 IgG의 실제 수준은 다발성 경화증의 두 테스트 된 설치류 모델의 CSF에서 크게 증가, 해당 연령 일치 가짜 컨트롤에 비해. R-EAE 마우스는 이 마우스에 있는 혈액 두뇌 방벽의 증가한 투과성을 나타내는 현저하게 향상된 알부민 몫 값을 보여줍니다.
반대로, TMEV-IDD와 샴 마우스 사이에 는 알부민 지수에 차이가 없으며, TMEV-IDD 마우스의 전형적 장벽의 이전 발견을 확증합니다. 또한, TMEV-IDD 동물에서는 IgG 지수 값이 현저히 높기 때문에 인트라더칼 IgG 생산이 관찰된다. 단백질 지수의 계산은 신경 염증성 및 신경 퇴행성 질환 모두에 대한 조기 진단, 결과 예측 및 질병 과정 모니터링에 유용한 새로운 단백질 바이오마커의 식별을 용이하게합니다.
