Questo protocollo consente al CSF e alla raccolta del sangue nella correzione quantitativa dei livelli proteici csf di misurare in una sintesi proteica tecale nei modelli di topo di disturbi neurologici. Questa procedura fornisce una linea di base, contro la quale è possibile valutare l'origine fisiopatologici delle proteine CSF di interesse e la stabilità e il significato funzionale del QCS del sangue favoriscono l'integrità. L'analisi della sintesi intertecale delle proteine e dell'integrità della barriera può essere applicata ad altri modelli animali e studi sull'uomo.
Ad esempio, per verificare la presenza di malattie del sistema nervoso centrale. Raccogliere volumi significativi di CSF pulito può essere tecnicamente impegnativo nei topi, quindi si consiglia di praticare la tecnica fino a quando non è possibile ottenere grandi volumi di campione incontaminato. A dimostrare le procedure sarà Micheal Linzey, studente laureato del programma di medicina sperimentale e molecolare al Dartmouth, nel nostro nuovo gruppo di ricerca immunologica.
Per la raccolta del siero tramite sanguinamento orbitale retrò. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale in un topo anestetizzato superiore a 15 grammi, afferrare la pelle sciolta dietro le orecchie con il pollice e l'indice della mano non dominante e utilizzare l'indice per disegnare la pelle sopra gli occhi. Usando il pollice per disegnare indietro la pelle sotto gli occhi, posizionare la punta di una pipetta Pasteur, tenuta con un angolo di circa 45 gradi, nella presa degli occhi sotto il bulbo oculare, diretta verso il centro dell'orbita oculare, mentre si ruota la pipetta tra le dita.
Quindi applicare una pressione breve e delicata e rilasciare per consentire al sangue di entrare nella pipetta. Una volta raccolto il campione di sangue, rimuovere delicatamente il capillare senza ferire l'occhio e trasferire il sangue in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Dopo aver chiuso la palpebra, applicare una leggera pressione con garza per prevenire ulteriori sanguinamenti.
Lasciare coagulare il sangue per 30-60 minuti a temperatura ambiente prima di filare il campione per centrifugazione. Utilizzando una tecnica di pipetta pulita, raccogliere il siero separato in una nuova fiala a 500 microliter etichettata e congelare immediatamente il siero a 80 gradi Celsius. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, rimuovere una superficie di capelli abbastanza ampia da consentire la raccolta del liquido spinale cerebrale immediatamente all'estremità caudale del cranio del topo anestetizzato.
Posizionare il mouse in una posizione soggetta a protezione su un dispositivo stereotassico in condizioni sterili e stabilizzare la testa con le barre dell'orecchio. Tamponare il sito chirurgico con il 30% di diacetato di clorexidina e rendere un'incisione cutanea sagittale inferiore all'occipite per esporre i muscoli sovrastano la cisterna magna. Usando le forcep, sezionare contundente il tessuto sottocutaneo e i muscoli e utilizzare micro retrattili per tenere separati i muscoli per esporre lo strato meningeo dura mater sulla cisterna magna.
Lavare delicatamente il tessuto con PBS sterile per rimuovere qualsiasi possibile contaminazione del sangue e utilizzare un batuffolo di cotone sterile per asciugare il dura mater. Il posizionamento della puntura iniziale alla cisterna magna è essenziale per ottenere un QCS abbondante e non contaminato. Utilizzando un ago calibro 30, forare delicatamente la membrana che copre la cisterna magna e inserire rapidamente e delicatamente un piccolo tubo capillare in vetro nella puntura.
Una volta raccolti da cinque a 12 microlitri di CSF, rimuovere con cura il tubo dalla membrana e utilizzare un pezzo di tubi in polietilene per collegare il tubo a una siringa da tre millilitri. Iniettare il QCS raccolto in un tubo di 500 microliter etichettato su ghiaccio e utilizzare un ago monouso e varie suture di polidioxanone per chiudere l'incisione. Pulire l'area di qualsiasi sangue o tessuto essiccato e posizionare il mouse in una gabbia pulita e calda con monitoraggio fino a piena reclinamento.
Raccogliere il CSF per centrifugazione e ispezionare visivamente il pellet e sovrapporlo per eventuali segni di contaminazione del sangue. Quindi, utilizzando la tecnica della pipetta pulita, trasferire il supernato contenente CSF in un nuovo tubo da 200 microliter e diluire il CSF a un rapporto uno o tre con PBS per lo stoccaggio immediato a 80 gradi Celsius. Per la raccolta del siero per puntura cardiaca, subito dopo la raccolta del CSF, come appena dimostrato, posizionare il mouse in posizione supina.
Tamponare la pelle addominale con il 70% di alcol. Utilizzare le forbici per aprire la cavità toracica, esponendo il cuore, e inserire un ago calibro 25 attaccato a una siringa da 3 millilitri nel ventricolo sinistro. Quindi applicare delicatamente la pressione negativa allo stantuffo della siringa, ritirando l'ago dopo che il sangue è stato raccolto.
Deprimere lo stantuffo per espellere il sangue raccolto in una fiala da 1,5 millilitri. Ora, lasciare coagulare il sangue per 30-60 minuti a temperatura ambiente prima di separare il siero per centrifugazione. Quindi, utilizzando una tecnica di pipetta pulita, trasferire il siero in una nuova fiala a 500 microliter etichettata per una conservazione immediata a 80 gradi Celsius.
Per quantificare le proteine bersaglio e l'albumina in campioni di siero e CSF abbinati, utilizzare un saggio standard di quantificazione delle proteine, utilizzando proteine standard referenziate per preparare una curva standard per ogni proteina di interesse. Dopo l'analisi, esportare i dati grezzi in un programma di grafica software appropriato e grafare l'intensità della fluorescenza del segnale di rilevamento rispetto alle concentrazioni proteiche standard per creare una curva standard per ogni proteina di interesse. Quindi, utilizzare le curve standard per calcolare le concentrazioni di ogni alita di interesse nei campioni.
Infine, utilizzare le concentrazioni di albume e di aliti target per calcolare i valori Q e l'indice intratecale. I livelli effettivi di IgG totale sono significativamente aumentati nel CSF di due modelli di roditori testati di sclerosi multipla, rispetto ai corrispondenti controlli fittizi abbinati all'età. I topi R-EAE mostrano valori quozienti di albumine significativamente migliorati, indicando una maggiore permeabilità della barriera emiencefalica in questi topi.
Al contrario, non esistono differenze nel quoziente di albume tra TMEV-IDD e topi fittizi, a conferma dei precedenti risultati di una barriera intatta nei topi TMEV-IDD. Inoltre, negli animali TMEV-IDD si osservano valori di indice IgG significativamente più elevati e, pertanto, la produzione intrateca di IgG. Il calcolo di un indice proteico facilita l'identificazione di nuovi biomarcatori proteici utili per la diagnosi precoce, la previsione dei risultati e il monitoraggio dei decorso delle malattie sia per le malattie neuroinfiammatorie che neurodegenerative.
