Ce protocole permet à la CSF et à la collecte de sang dans la correction quantitative des niveaux de protéine de CSF de mesurer dans une synthèse de protéine thecal dans les modèles de souris des désordres neurologiques. Cette procédure fournit une ligne de base, contre laquelle l’origine pathophysiologique des protéines CSF d’intérêt, et la stabilité et la signification fonctionnelle de l’intégrité de faveur de CSF de sang peuvent être évaluées. L’analyse de la synthèse des protéines interthéales et de l’intégrité des barrières peut être appliquée à d’autres modèles animaux et à des études humaines.
Par exemple, pour vérifier les maladies du système nerveux central. La collecte de volumes importants de CSF propre peut être techniquement difficile chez la souris, de sorte que la pratique de la technique jusqu’à ce que de grands volumes d’échantillon non contaminé peut être obtenu est conseillé. Micheal Linzey, un étudiant diplômé du programme de médecine expérimentale et moléculaire de Dartmouth, fera partie de notre nouveau groupe de recherche en immunologie.
Pour la collecte de sérum par l’intermédiaire du saignement orbital rétro. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale dans une souris anesthésiée de plus de 15 grammes, saisissez la peau lâche derrière les oreilles avec le pouce et l’index de la main non dominante, et utilisez l’index pour tirer la peau au-dessus des yeux. À l’aide du pouce pour ramener la peau sous les yeux, placez la pointe d’une pipette Pasteur, maintenue à un angle d’environ 45 degrés, dans la douille des yeux sous le globe oculaire, dirigée vers le milieu de la prise des yeux, tout en tournant la pipette entre les doigts.
Appliquez ensuite une pression brève et douce et relâchez pour permettre au sang d’entrer dans la pipette. Lorsque l’échantillon de sang a été prélevé, retirez doucement le capillaire sans blesser l’œil et transférez le sang dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Après avoir fermé la paupière, appliquer une légère pression avec de la gaze pour éviter d’autres saignements.
Laisser le sang coaguler de 30 à 60 minutes à température ambiante avant de faire tourner l’échantillon par centrifugation. À l’aide d’une technique de pipette propre, recueillir le sérum séparé en un nouveau flacon de 500 microlitres étiqueté, et congeler immédiatement le sérum à 80 degrés Celsius. Après avoir confirmé l’absence de réponse au réflexe de pédale, enlever une zone assez grande de cheveux pour permettre la collecte du liquide céphalo-rachidien immédiatement à l’extrémité caudale du crâne de la souris anesthésiée.
Placez la souris en position couchée sur un appareil stéréotaxique dans des conditions stériles, et stabilisez la tête avec des barres d’oreille. Écouvillonner le site chirurgical avec 30% de chlorhexidine diacétate, et faire une incision sagittale de la peau inférieure à l’occiput pour exposer les muscles qui survolent la magna cisterna. À l’aide de forceps, émoussé disséquer le tissu sous-cutané et les muscles, et utiliser des micro rétractateurs pour tenir les muscles à part pour exposer la couche méningée dura mater sur la magna cisterna.
Lavez doucement les tissus avec du PBS stérile pour éliminer toute contamination possible du sang, et utilisez un coton-tige stérile pour éponger le dura mater sec. Le positionnement de la ponction initiale à la magna cisterna est essentiel pour obtenir abondante, non contaminé CSF. À l’aide d’une aiguille de calibre 30, perforez doucement la membrane qui recouvre la cisterna magna et insérez rapidement et doucement un petit tube capillaire en verre dans la perforation.
Lorsque cinq à 12 microlitres de CSF ont été collectés, retirez soigneusement le tube de la membrane et utilisez un morceau de tube de polyéthylène pour connecter le tube à une seringue de trois millilitres. Injectez le CSF recueilli dans un tube de 500 microlitres étiqueté sur la glace, et utilisez une aiguille jetable et des sutures variées de polydioxanone pour fermer l’incision. Nettoyez la zone de tout sang ou tissu séché, et placez la souris dans une cage propre et chaude avec surveillance jusqu’à ce que la charge complète.
Recueillir le CSF par centrifugation, et inspecter visuellement la pastille et la supernate pour tout signe de contamination du sang. Ensuite, à l’aide d’une technique de pipette propre, transférez le supernate contenant du CSF dans un nouveau tube de 200 microlitres et diluez le CSF à un rapport d’un à trois avec PBS pour un stockage immédiat à 80 degrés Celsius. Pour la collecte du sérum par perforation cardiaque, immédiatement après la collecte CSF, comme nous venons de le démontrer, placez la souris dans la position de supination.
Écouvillonner la peau abdominale avec 70% d’alcool. Utilisez des ciseaux pour ouvrir la cavité thoracique, exposant le cœur, et insérez une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue de 3 millilitres dans le ventricule gauche. Ensuite, appliquez doucement une pression négative sur le piston de seringue, en retirant l’aiguille après que le sang a été recueilli.
Déprimez le piston pour éjecter le sang recueilli dans un flacon de 1,5 millilitre. Maintenant, laissez le sang coaguler pendant 30 à 60 minutes à température ambiante avant de séparer le sérum par centrifugation. Ensuite, à l’aide d’une technique de pipette propre, transférer le sérum dans un nouveau flacon de 500 microlitres étiqueté pour un stockage immédiat à 80 degrés Celsius.
Pour quantifier les protéines cibles et l’albumen dans des échantillons de sérum et de CSF appariés, utilisez un test standard de quantification des protéines, en utilisant des protéines standard référencées pour préparer une courbe standard pour chaque protéine d’intérêt. Après l’analyse, exportez les données brutes vers un programme de graphique logiciel approprié, et graphiquez l’intensité de fluorescence du signal de détection par rapport aux concentrations standard de protéines pour créer une courbe standard pour chaque protéine d’intérêt. Ensuite, utilisez les courbes standard pour calculer les concentrations de chaque analyte d’intérêt dans les échantillons.
Enfin, utilisez l’albumen et ciblez les concentrations d’analyte pour calculer les valeurs Q et l’indice intrathécal. Les niveaux réels de l’IgG total sont sensiblement augmentés dans le CSF de deux modèles éprouvés de rongeur de sclérose en plaques, comparés aux contrôles simulés assortis d’âge correspondant. Les souris de R-EAE montrent des valeurs significativement améliorées de quotient d’albumen, indiquant une perméabilité accrue de la barrière de cerveau de sang dans ces souris.
Nonversely, aucune différence dans le quotient d’albumen n’existe entre TMEV-IDD et souris factices, corroborant des résultats précédents d’une barrière intacte chez les souris TMEV-IDD. En outre, chez les animaux TMEV-IDD, des valeurs significativement plus élevées de l’indice IgG et, par conséquent, la production intrathécale d’IgG sont observées. Le calcul d’un indice protéique facilite l’identification de nouveaux biomarqueurs protéiques utiles pour le diagnostic précoce, la prévision des résultats et la surveillance des cours sur les maladies pour les maladies neuro-inflammatoires et neurodégénératives.
