يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص مكتبات فحص العدسي أو الفيروسية الرجعية لتحديد المنظمين رواية عوامل النسخ في الخلايا السرطانية. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة ومتوسطة الإنتاجية وغير مكلفة ، وأنها تستخدم المعدات والكواشف التي يمكن الوصول إليها عادة لمعظم المحققين. لتوسيع وتنقية كل متجه من المغذيات الناظرة في المكتبة، أضف أولاً 1.3 ملليلتر من مرق لوريا المُكمَّل بـ 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين إلى كل بئر من 96 بئراً.
تلقيح كل بئر مع اثنين من microliters من مخزون الجلسرين لاحتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية و 225 الثورات في الدقيقة الواحدة. في اليوم التالي، نقل كل ثقافة البكتيريا إلى الفردية 1.5 ملليلتر microcentuge أنابيب للطرد المركزي. تنقية كل ناقل مع مجموعة صغيرة البكتيريا المناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
لكل ناقل في المكتبة المعدة، بذور بئر واحد من لوحة 24-جيدا مع واحد مرات 10 إلى الخلايا الخامسة 293FT واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. لإعداد خليط transfection التي سيتم إعدادها لكل ناقل في المكتبة، أولاً elute كل متجه العدسي إلى تركيز نهائي من 50 نانوغرام لكل ميكرولتر مع مياه خالية من النوى. نقل خمسة ميكروليتر من كل تخفيف في آبار فردية من لوحة PCR 96-well.
جعل مزيج فائق transfection عن طريق خلط 1.25 ميكرولتراترز مرات x من كاشف transfection واحد مع 23.75 ميكرولتررز مرات x من العازلة ما قبل الدافئة transfection. احتضان مزيج فائق transfection في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم إضافة 125 نانوغرام مرات x من psPAX2 و 125 نانوغرام مرات x من VSVG إلى مزيج فائق مع الأنابيب لطيف.
aliquot على الفور مزيج السوبر في كل أنبوب من شريط PCR واستخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 25 ميكرولترات من الخليط في كل بئر من ناقلات الفيروسية المخفف. بعد حضانة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، واستخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 30 ميكرولترات من كل خليط transfection من كل بئر إلى بئر المقابلة من الخلايا 293FT في لوحة 24-جيدا أعدت سابقا. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة قبل استبدال المتوسطة في كل بئر مع 500 ميكرولترات من متوسط النمو الكامل الطازجة لاحتضان آخر على مدار 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية.
في اليوم التالي ، استخدم ماصة متعددة القنوات لجمع الماين الفيروسي من كل بئر و aliquot 220 ميكرولترات من كل اضخم في بئرين في لوحة جديدة 96-well لتوليد لوحة كبيرة فيروسية مصفّعة. لإعداد الخلايا A375 للعدوى، بذور مرة واحدة 10 إلى الخلايا الخامسة في لوحة 24-جيدا في 0.5 ملليلتر من متوسط النمو الكامل لكل بئر لكل متجه الفيروسية في المكتبة. وتشمل أيضاً إضافية لن تكون مصابة لتكون بمثابة مراقبة لاختيار المخدرات.
بعد حضانة لمدة 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية ، اذيب الاسطون المصفى المجمد مجموعة فائقة على درجة حرارة الغرفة قبل استبدال متوسط النمو من كل بئر من لوحة ثقافة الخلية المعدة مع 200 ميكرولترات من متوسط النمو تكملها 20 ميكروغرام لكل ملليلتر من البوليبرين. باستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 200 ميكرولترات من الفيروسية العملاقة من كل 96 جيدا إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. إعادة الخلايا إلى الحاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 إلى 48 ساعة.
في نهاية الحضانة، واستبدال المتوسطة في كل بئر مع 500 ميكرولترات من متوسطة النمو تكمل مع البوسوميسين والعودة إلى الخلايا الحاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة إضافية. بعد اختيار البوروميسين لمدة 48 ساعة ، قم بفرز الخلايا إلى ثلاث أو أربع مجموعات بحيث تحتوي جميع الآبار في مجموعة واحدة على كثافة خلايا مماثلة وإضافة 200 ميكرولترات من التربسين -EDTA إلى ممثل واحد جيدًا من كل مجموعة لاحتضان لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. مرة واحدة قد فصلت الخلايا، تحييد التربسين مع 400 ميكرولترات من متوسطة النمو تستكمل مع البورومايسين وعدد من الخلايا من كل التربسينيد جيدا.
تمييع كل تعليق خلية إلى مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر التركيز مع متوسط النمو تكملها البوروميسين والبذور 500 ميكرولتر من الخلايا من كل بئر في نفس الوضع جيدا في لوحة جديدة 24-جيدا. بعد استخدام العد من كل ممثل جيدا لتقدير عدد الخلايا في كل ما تبقى بشكل جيد في كل مجموعة، إضافة حجم مناسب من التربسين-EDTA إلى كل بئر لتحقيق واحد مرات 10 إلى الخلايا السادسة في تركيز المليلتر. أثناء التربسينينيونية، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 400 ميكرولترات من متوسطة النمو المكملة مع البورومايسين إلى الآبار المناسبة المقابلة في لوحة 24-well الجديدة.
مرة واحدة قد فصلت الخلايا، بلطف مزيج محتويات كل بئر ونقل 100 ميكرولترات من كل تعليق الخلية إلى مناسبة المقابلة جيدا في لوحة جديدة 24-جيدا. ثم قم بإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة. لtransfect الخلايا مع ثنائي luciferase المراسل يبني، وإعداد خليط التخفيف transfection كما هو مبين في الجدول.
لتحضير خليط تخفيف المراسل، اخلطي أحجام كل كاشف مضروبة في العدد الإجمالي للعابرة بالإضافة إلى عدة وحدات تخزين إضافية. بعد ذلك، اخلطي خليط تخفيف النتروبات مع خليط تخفيف المراسل وحضن المحلل الناتج في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لإنتاج خليط transfection. خلال الحضانة، شطف كل بئر من لوحة ثقافة الخلية مع 250 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني وإضافة 447 ميكرولترات من نمو كامل جديد المتوسطة لكل بئر.
ثم استخدام ماصة متعددة القنوات لتوزيع 53 ميكرولترات من مزيج transfection إلى كل بئر من لوحة ثقافة الخلية. ضع الصفيحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. لقياس نشاط لوسيفراز، تمييع 5X العازلة السلبية من مجموعة نشاط لوسيفيراز في تخفيف واحد إلى خمسة مع المياه غير المؤينة وذوبان الكميات اللازمة من الكاشف A والمكاشف B العازلة من عدة.
عندما تكون الكواشف جاهزة ، استبدل المابير في كل بئر بـ 75 ميكرولترات من عازلة التحلل السلبي واحتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز عرضي. أثناء الحضانة، وتمييع الركيزة 50X مُكْشف B من المجموعة إلى تركيز واحد إلى 50 مع عازلة المذابة ب الكاشف. في نهاية الحضانة، إضافة 30 microliters من العازلة التحلل السلبي إلى أربعة آبار التحكم فارغة ونقل 30 microliters من lysate من كل بئر إلى آبار مكررة من 96 مسطحة جيدا أسفل لوحة فحص بيضاء.
عندما تم مطلي كل من lysate، واستخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولترات من الكاشف A إلى كل بئر وقراءة إشارة لوسيفراز اليراعة مع قارئ لوحة. ثم استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولترات من B الكاشف إلى كل بئر وقراءة إشارة luciferase رينايلا مع قارئ لوحة. كما هو متوقع، YAP2SA يزيد من نشاط لوسيفراز اليراعات ولكن ليس نشاط رينيهيلا لوسيفالاس بالمقارنة مع ناقلات التحكم.
في المقابل، YAP2SA S94A لا يزيد من نشاط لوسيفايراس اليراعات. الأهم من ذلك، YAP2SA لا يغير نشاط بناء المروج الحد الأدنى الذي يفتقر إلى عناصر الربط تييد MCAT. في الخلايا التي تحتوي على المقاومة YAP-TAZ-TEAD بناء مراسل، وتاند YAP وTAZ دبابيس الشعر قصيرة خفضت بشكل كبير مستويات الثيريفلاي لوسيفراز، ولكن السيطرة على دبابيس الشعر قصيرة غير استهداف السيطرة لا.
في المقابل، في الخلايا التي تُصاب بأدنى مستوى من بناء المراسل، فإن رنا ناوب الشعر القصير YAP-TAZ لا يغير بشكل كبير مستويات اليراعات في النفّاس. إشارة رينايلا في كل بئر أيضا لا تتغير بشكل كبير من قبل عنصر التحكم في دبوس الشعر القصير غير الاستهداف أو RNA RNA PIN الشعر القصير YAP-TAZ. كما هو متوقع، رناس دبوس الشعر القصير التي تستهدف YAP وTAZ، SARC أو PI3 كيناز يقلل بشكل كبير من النشاط YAP-TAZ-TEAD.
RNAs قصيرة دبوس الشعر التي تستهدف أجهزة الصراف الآلي، CDH1، CSK، ERBB2، وgelsolin كل زيادة مستويات لوسيفراز اليراعات تطبيع تتفق مع الدراسات المنشورة التي تبين أن هذه البروتينات كانت YAP و / أو TAZ. على الرغم من الأدوار الراسخة ل ATR وCCNE2 و ERBB4 في أنواع الخلايا الأخرى ، فإن RNAs قصير دبوس الشعر الذي يستهدف هذه الجينات لا يغير بشكل كبير مستويات لوسيفراز اليراعات الطبيعية في الخلايا A375. بعد هذه الشاشة، يجب التحقق من تحديد المنظمين باستخدام قراءات أخرى لنشاط عامل النسخ الخاصة بهم.
وينبغي أيضا تأكيد الضربة القاضية الفعالة للمنظم المحدد من قبل الفحص. تذكر أن تُحذِر وأن تتبع إرشادات السلامة عند العمل مع فيروسات العدس المعدية، خاصة إذا كانت الفيروسات بشرية معدية.
