نحن نذهب لشرح بروتوكولين اليوم التي توضح كيفية دراسة الدالة خلية NK. هناك جانبان رئيسيان لوظيفة الخلايا NK التي هي قادرة على القضاء على الخلايا السرطانية وانها قادرة على الهجرة إلى البيئة الدقيقة الورم. هذان البروتوكولان سنبرهن على قدرة الخلايا النيكية على استئصال الخلايا السرطانية وأيضاً أنها قادرة على الهجرة إلى بيئة الورم الجزئية.
لذا فإن البروتوكولين اللذين سنبرهن عليها اليوم مباشرتان، ولا يتطلبان استخدام النشاط الراديوي ويمكن أن يتم إنشاؤها في معظم المختبرات التي لديها القدرة على القيام بعمل البيولوجيا الجزيئية وثقافة الخلايا. (سوريش بوغيد) و(سوريش شافا) اللذان هما شريكان ما بعد الدكتوراه في مختبري سيبرهنان على هذين البروتوكولين اليوم تقييم اثنين من الخلايا NK بوساطة السمية الخلوية باستخدام LDH، تنمو أولا خط خلية سرطان الكبد البشري إلى 70-80٪ التقاء في 100 ملليمتر خلية ثقافة طبق بيتري في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في يوم التجربة، وغسل الثقافة مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل علاج الخلايا مع ملليلتر واحد من 0.25٪ التربسين EDTA حتى الخلايا قد انفصلت عن أسفل لوحة. عندما تم الحصول على تعليق خلية واحدة إضافة 10 ملليلتر من خلية ثقافة المتوسطة للخلايا ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي. غسل بيليه الخلية مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل إعادة تعليق الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا 5 لكل ملليلتر من تركيز متوسط الثقافة الطازجة.
بعد ذلك، بذور 100 ميكرولترات من الخلايا السرطانية الكبد البشرية المستهدفة في كل بئر في ثلاث مرات لكل حالة العلاج في لوحة 96 جيدا وإضافة مرة واحدة 10 إلى الخلايا NK الإنسان 5 في 100 ميكرولترات من المتوسطة لكل خلية الهدف جيدا. ثم ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاث ساعات. في نهاية الحضانة، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي ونقل 100 ميكرولترات من اغراء من كل بئر إلى آبار فردية من لوحة 96 بئر جديدة.
إضافة 50 ميكرولترات من الركيزة LDH إلى كل بئر مع خلط شامل واحتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وإلقاء القبض على رد فعل مع 50 ميكرولترات من حل التوقف وقياس على الفور امتصاص على قارئ لوحة في 490 و 680 نانومتر. ثم استخدم الصيغة لحساب نسبة NK خلية السمية الخلوية.
لتقييم NK الخلية توسطت السامة للخلايا باستخدام calcein AM بعد نمو خلايا خلايا سرطان الكبد البشرية إلى التقاء 70-80٪ كما أظهرت إعادة تعليق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من DMEM خالية من المصل وتسمية الخلايا مع 1.5 ميكرولترات من 10 ملولار حل CALCEIN AM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسل الخلايا مرتين مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل. إعادة تعليق الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا 5 لكل ملليلتر من تركيز متوسط الثقافة وإضافة 100 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من 96 لوحة جيدا في ثلاث مرات لكل حالة العلاج.
بعد ذلك ، في مرة واحدة 10 إلى خلايا NK البشرية 5 في 100 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة لكل بئر من الخلايا المستهدفة ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة أربع ساعات. بعد نهاية الحضانة، والتقاط ما لا يقل عن 10 حقول مختلفة من الصور من الخلايا الإيجابية في 19 AM calcein لكل تكرار لكل حالة العلاج على المجهر الفلوري في التكبير 10 مرات. ثم حساب نسبة السمية الخلوية باستخدام الصيغة.
لقياس NK الخلية الهجرة استجابة لمحفزات كيميائي جمع خلايا NK الإنسان من 70-80٪ التقاء الثقافة وإعادة تعليق الخلايا في 2.5 مرات 10 إلى الخلايا 6 لكل ملليلتر من المصل خالية من الخلايا NK تركيز متوسطة. بعد ذلك، إضافة 600 ميكرولترات من المتوسطة خالية من المصل التي تحتوي على الكيميائية خلية NK جذب الفائدة في كل بئر ووضع واحد 6.5 ملليمتر قطر الثقافة إدراج مع خمسة ميكرومتر المسام في كل بئر من المتوسطة. ثم إضافة 100 ميكرولترات من خلايا NK إلى المقصورة العليا من كل إدراج ووضع لوحة في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة أربع ساعات.
في نهاية الحضانة نقل كامل حجم الخلايا غير أتباع هاجر من أسفل كل بئر في أنابيب FACS 5 ملليلتر الفردية وإضافة 50 ميكرولترات من عدد محدد سلفا من تدفق الخرز العد الخلايا إلى كل أنبوب. ثم باستخدام تدفق مقياس الخلايا تقييم كل عينة الخلية وفقا لبروتوكولات التحليل السيتومي القياسية تدفق وحساب العدد المطلق من الخلايا NK هاجر باستخدام الصيغة. ATF4 الضربة القاضية يقلل بشكل كبير من NK خلية بوساطة السمية الخلوية مقارنة مع خلايا NK التعبير عن غير محددة دبوس الشعر القصير RNA.
بعد تلطيخ مع calcein AM عدد خلايا سرطان الكبد البشرية قابلة للحياة ينخفض بعد المشاركة في الثقافة مع الخلايا NK الإنسان مقارنة مع خلايا سرطان الكبد البشرية المستزرعة دون خلايا NK. كما هو متوقع، ATF4 الضربة القاضية عن طريق رنا الشعر القصير يقلل من قتل الخلايا NK بوساطة خلايا سرطان الكبد البشرية كما يتضح من عدد أكبر من الخلايا الإيجابية في هذه الثقافات. بالإضافة إلى ذلك، يتم ملاحظة كمية أعلى بكثير من NK الخلية migration استجابة لـ chemokine-تحتوي على المتوسطة مقارنة بالخلايا NK المعرضة لواسطة التحكم بدون chemokine.
لNK الخلية السمية للخلايا تقييم من المهم لتوحيد جهودنا والنسب المستهدفة ووقت الحضانة لكل خط الخلايا السرطانية. مرة واحدة يتم تحديد المعايير والتحقق من صحة في المختبر تقييم تستكمل مع في تجارب الفئران في الجسم الحي لمزيد من تقييم دورها في استئصال الخلايا السرطانية.
