אנחנו הולכים להדגים שני פרוטוקולים היום המדגימים כיצד ללמוד תפקוד תאי NK. ישנם שני היבטים מרכזיים של תפקוד תאי NK כי הוא מסוגל למגר תאים סרטניים והוא מסוגל לנדוד לסביבת מיקרו הגידול. שני הפרוטוקולים האלה נדגים את היכולת של תאי NK להשמיד תאים סרטניים וגם הוא מסוגל לנדוד לסביבת מיקרו הגידול.
אז שני הפרוטוקולים שאנחנו הולכים להדגים היום הם פשוטים, אינו דורש שימוש בפעילות רדיו ו ניתן ליצור ברוב המעבדות כי יש את היכולת לעשות ביולוגיה מולקולרית ותרבות התא לעבוד. אורש בוגיד ונורש חוה, שהם שני פוסט דוקטורנטים במעבדה שלי, ידגימו את שני הפרוטוקולים האלה היום. שני להעריך NK תא בתיווך cytotoxicity באמצעות LDH, הראשון לגדל קו תאים סרטן הכבד האנושי ל 70-80% confluency בצלחת 100 מילימטר תאים פטרי ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
ביום הניסוי, לשטוף את התרבות עם חמישה מיליליטר של PBS לפני הטיפול בתאים עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA עד התאים התנתקו מהתחתית צלחת. כאשר ההשעיה תא יחיד הושג להוסיף 10 מיליליטר של תאים בינוני לתאים ולהעביר את התאים צינור חרוט 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. לשטוף את גלולת התא עם חמישה מיליליטר של PBS לפני השעיית התאים מחדש באחת פעמים 10 לתאים 5 למיליליטר של ריכוז בינוני תרבות טרי.
לאחר מכן, זרע 100 microliters של תאי סרטן הכבד האנושי היעד ל הבא בטריליקט לכל מצב טיפול בצלחת 96 גם ולהוסיף פעם אחת 10 לתאי NK האנושיים 5 ב 100 microliters של בינוני לכל תא היעד היטב. ואז למקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך שלוש שעות. בסוף הדגירה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ולהעביר 100 microliters של supernatant מכל באר לתוך בארות בודדות של צלחת חדשה 96 באר.
הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מצע LDH לכל באר עם ערבוב יסודי ודגירה של הצלחת במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם 50 microliters של פתרון להפסיק ומיד למדוד את הספיגה על קורא צלחת ב 490 ו 680 ננומטר. לאחר מכן השתמש בנוסחה כדי לחשב את ציטוקסיות תא NK אחוז.
כדי להעריך ציטוטוקסיות מתווכים תא NK באמצעות קלצין AM לאחר גידול תאי קו התא סרטן הכבד האנושי ל 70-80% confluency כפי שהוכח מחדש להשעות את התאים בשלושה מיליליטר של DMEM ללא סרום ולתייג את התאים עם 1.5 microliters של 10 פתרון calcein AM מילימולרית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף. להשעות מחדש את התאים באחת פעמים 10 לתאים 5 למיליליטר של ריכוז בינוני תרבות ולהוסיף 100 microliters של תאים לכל באר של צלחת 96 גם ב טרילקט לכל מצב טיפול.
לאחר מכן, באחת הפעמים 10 עד 5 תאי NK אנושיים ב 100 microliters של תרבות בינוני לכל באר של תאי היעד ולמקום את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך ארבע שעות. לאחר סיום הדגירה, ללכוד לפחות 10 שדות שונים של תמונות של התאים החיוביים calcein AM עבור כל שכפול של כל מצב טיפול על מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה 10 פעמים. לאחר מכן חשב את אחוז הציטוקסיקות באמצעות הנוסחה.
כדי למדוד את נדידת תאי NK בתגובה לגירויים chemotactic לאסוף תאי NK אנושיים מתרבות 70-80%confluent ולהשעות מחדש את התאים ב 2.5 פעמים 10 לתאים 6 למיליליטר של ריכוז בינוני תרבות תאי NK ללא סרום. לאחר מכן, להוסיף 600 microliters של מדיום ללא סרום המכיל את כימותרפיה תא NK מושך עניין ל הבאר ולמקם אחד 6.5 מילימטר קוטר תרבות להוסיף עם חמש נקבוביות מיקרומטר לתוך כל באר של בינוני. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תאי NK לתא העליון של כל הכנס והכניסו את הלוחית בחמה לתרבות התאים למשך ארבע שעות.
בסוף הדגירה להעביר את כל הנפח של תאים נודדים שאינם חסידים מתחתית כל באר לתוך צינורות FACS בודדים חמישה מיליליטר ולהוסיף 50 microliters של מספר קבוע מראש של ציטומטריית זרימה ספירת חרוזים לכל צינור. לאחר מכן, באמצעות ציטומטר זרימה להעריך כל דגימת תא על פי פרוטוקולי ניתוח ציטומטרי זרימה סטנדרטיים ולחשב את המספר המוחלט של תאי NK שהועברו באמצעות הנוסחה. ההפלה ATF4 מפחיתה באופן משמעותי את הציטוקסיקטיות של תאי NK בהשוואה לתאי NK המבטאים רנ"א סיכת ראש קצר לא ספציפי.
לאחר הכתם עם calcein AM מספר תאים סרטניים בכבד אנושי קיימא פוחתת לאחר שיתוף תרבות עם תאים NK אנושי לעומת תאים סרטניים בכבד אנושי מתורבת ללא תאי NK. כצפוי, ATF4 נוקאאוט באמצעות RNA סיכת ראש קצרה מפחית הרג תאי NK של תאים סרטניים בכבד אנושי כפי שמוצג על ידי מספר גדול יותר של תאים קלצין AM חיובי בתרבויות אלה. בנוסף, כמות גבוהה משמעותית של הגירת תאי NK נצפתה בתגובה למדיום המכיל כימוקין בהשוואה לתאי NK החשופים לשליטה בינונית ללא כימוקין.
להערכת ציטוטוקסיות של תאי NK חשוב לתקנן את יחסי המאמץ והיעד שלנו ואת זמן הדגירה עבור כל קו תאים סרטניים. לאחר התקנים מזוהים מאומתים להערכת במבחנה מתווספים עם ניסויים בעכברים vivo כדי להעריך עוד יותר את תפקידם בהכחדת תאים סרטניים.
