Bugün NK hücre işlevini niçin inceleyeceğimi gösteren iki protokol göstereceğiz. NK hücre fonksiyonunun iki temel yönü vardır ki tümör hücrelerini yok edebiliyor ve tümör mikro ortamına göç edebiliyoru. Bu iki protokol, Tümör hücrelerini yok etme yeteneğini NK hücre yeteneğini göstereceğiz ve ayrıca tümör mikro ortamına da göç edebilecek.
Yani bugün göstereceğimiz iki protokol basittir, radyo aktivitesi nin kullanılmasını gerektirmez ve moleküler biyoloji ve hücre kültürü çalışması yapma yeteneğine sahip çoğu laboratuvarda kurulabilir. Laboratuvarımda doktora sonrası çalışan Suresh Bugide ve Suresh Chava bugün bu iki protokolü gösterecekler. İki LDH kullanarak NK hücre aracılı sitotoksisite değerlendirmek, ilk 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 100 milimetre hücre kültürü Petri çanak% 70-80 birleşimi için bir insan karaciğer kanseri hücre hattı büyümek.
Deney günü, hücreler plaka alttan ayrılana kadar hücreleri %0,25 tripsin EDTA mililitresi ile tedavi etmeden önce kültürü beş mililitre PBS ile yıkayın. Tek bir hücre süspansiyon elde edildiğinde hücrelere hücre kültürü orta 10 mililitre ekleyin ve santrifüj için 15 mililitre konik tüp hücreleri aktarın. Hücre peletini beş mililitre PBS ile yıkayın ve hücreleri bir defadan 10'da 5'inci hücrelere yeniden askıya alarak taze kültür orta konsantrasyonuna yerleştirin.
Sonra, tohum 100 mikrolitre hedef insan karaciğer kanseri hücrelerinin iyi bir 96 iyi plaka içinde tedavi durumu başına triplicate başına ve her hedef hücre ye orta 100 mikrolitre 5 insan NK hücrelerine bir kez 10 ekleyin. Sonra üç saat boyunca hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri pelet ve yeni bir 96 kuyu plaka bireysel kuyular içine her kuyudan supernatant 100 mikrolitre aktarın.
Her kuyuya 50 mikrolitre LDH substratekleyin ve plakayı ışıktan korunan oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, 50 mikrolitre stop çözeltisi ile reaksiyonu durdurun ve 490 ve 680 nanometredeki bir plaka okuyucusunun emilimi hemen ölçün. Sonra yüzde NK hücre sitotoksisitesi hesaplamak için formülü kullanın.
NK hücre aracılı cytotoksisite kalsein kullanarak insan karaciğer kanseri hücre hattı hücreleri büyüdükten sonra değerlendirmek için 70-80% kollektisi olarak serum içermeyen DMEM üç mililitre hücreleri yeniden askıya ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 10 milimolar calcein çözeltisi 1.5 mikrolitre ile hücreleri etiket. Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve yıkama başına PBS beş mililitre ile hücreleri iki kez yıkayın. Kültür orta konsantrasyonmililitre başına 5 hücreleri bir kez 10 hücreleri yeniden askıya almak ve tedavi durumu başına triplicate bir 96 iyi plaka her kuyuya hücrelerin 100 mikrolitre ekleyin.
Daha sonra, bir defada 10 ila 5. Kuluçka bitiminden sonra, 10 kat büyütülme de bir floresan mikroskop üzerinde her tedavi koşulu çoğaltmak için kalsin pozitif hücrelerin görüntülerin en az 10 farklı alanları yakalamak. Sonra formülü kullanarak yüzde sitotoksisite hesaplayın.
Kemotaktik uyaranlara yanıt olarak NK hücre göçünü ölçmek için insan NK hücrelerini %70-80'lik bir karışım kültüründen toplar ve hücreleri serumsuz NK hücre kültürü orta konsantrasyonunun mililitresi başına 2,5 kat 10'dan 6'ncı hücrelere yeniden askıya alır. Daha sonra, her kuyubaşına ilgi NK hücre kemo çeken içeren serum içermeyen orta 600 mikrolitre ekleyin ve orta her kuyu içine beş mikrometre gözenekleri ile bir 6,5 milimetre çapında kültür eklemek yerleştirin. Daha sonra her bir kesici uç üst bölmesine 100 mikrolitre NK hücresi ekleyin ve plakayı dört saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Kuluçka sonunda, yapışık olmayan hücrelerin tüm hacmi her kuyunun altından beş mililitrelik FACS tüplere aktarılır ve her tüpe boncuk sayma damama önceden belirlenmiş sayıda 50 mikrolitre akış sitometrisi ekleyin. Daha sonra bir akış sitometre kullanarak standart akış sitometrik analiz protokollerine göre her hücre örneğini değerlendirmek ve formülü kullanarak geçirilen NK hücrelerinin mutlak sayısını hesaplamak. ATF4 nakavt önemli ölçüde non-spesifik kısa saç tokası RNA ifade NK hücreleri ile karşılaştırıldığında NK hücre aracılı sitotoksisite azaltır.
Kalcein ile boyama sonra canlı insan karaciğer kanser hücrelerinin sayısı insan NK hücreleri ile insan karaciğer kanser hücreleri nk hücreleri olmadan kültürlü göre co-kültür sonra azalır. Beklendiği gibi, kısa saç tokası RNA ile ATF4 knockdown bu kültürlerde kalcein AM-pozitif hücrelerin daha fazla sayıda kanıtlanınca insan karaciğer kanseri hücrelerinin NK hücre aracılı öldürme azaltır. Buna ek olarak, kemokin içeren ortama yanıt olarak, kemokin içermeyen kontrol ortamına maruz kalan NK hücrelerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek miktarda NK hücre göçü gözlenmektedir.
NK hücre sitotoksisitesi için her kanser hücresi hattı için çaba ve hedef oranları ve kuluçka süresi standartlaştırmak için önemlidir değerlendirmek. Standartlar belirlendikten ve doğrulandıktan sonra in vitro değerlendirme tümör hücresi eradikasyonundaki rollerini daha fazla değerlendirmek için in vivo fare deneyleri ile desteklenir.
