Vamos demonstrar dois protocolos hoje que demonstram como estudar a função celular NK. Há dois aspectos-chave da função celular NK que é capaz de erradicar células tumorais e é capaz de migrar para o micro ambiente tumoral. Esses dois protocolos vamos demonstrar a capacidade celular NK de erradicar células tumorais e também é capaz de migrar para o micro ambiente tumoral.
Assim, os dois protocolos que vamos demonstrar hoje são simples, não exigem uso de atividade de rádio e podem ser estabelecidos na maioria dos laboratórios que tem a capacidade de fazer biologia molecular e trabalho de cultura celular. Suresh Bugide e Suresh Chava, que são dois associados pós-doutorado no meu laboratório, vão demonstrar esses dois protocolos hoje. Dois avaliam a citotoxicidade mediada por células NK usando LDH, primeiro crescem uma linha de células cancerígenas do fígado humano para 70-80% de confluência em uma placa petri de cultura celular de 100 milímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
No dia do experimento, lave a cultura com cinco mililitros de PBS antes de tratar as células com um mililitro de 0,25% de trippsina EDTA até que as células se despevem do fundo da placa. Quando uma única suspensão celular tiver sido obtida adicione 10 mililitros de cultura celular ao meio das células e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Lave a pelota celular com cinco mililitros de PBS antes de suspender as células em uma única vez 10 a 5 células por mililitro de concentração média de cultura fresca.
Em seguida, semente 100 microliters das células de câncer de fígado humano alvo por poço em triplicado por condição de tratamento em uma placa de 96 poços e adicionar uma vezes 10 às 5 células NK humanas em 100 microliters de médio para cada célula alvo bem. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular por três horas. No final da incubação, pelota as células por centrifugação e transfira 100 microliters de supernascer de cada poço para poços individuais de uma nova placa de poço 96.
Adicione 50 microliters de substrato LDH a cada poço com uma mistura completa e incubar a placa por 20 minutos à temperatura ambiente protegida da luz. No final da incubação, prenda a reação com 50 microliters de solução stop e meça imediatamente a absorvância em um leitor de placas em 490 e 680 nanômetros. Em seguida, use a fórmula para calcular a citotoxicidade celular NK por cento.
Avaliar a citotoxicidade mediada por células NK usando calcein AM depois de cultivar células de linha de células cancerígenas do fígado humano para uma confluência de 70-80%, como demonstrado, suspenda as células em três mililitros de DMEM sem soro e rotule as células com 1,5 microliters de 10 mililitros de solução AM de calceina por 30 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, recolham as células por centrifugação e lavem as células duas vezes com cinco mililitros de PBS por lavagem. Suspenda as células em uma única vez 10 a 5 células por mililitro de concentração média cultural e adicione 100 microliters de células a cada poço de uma placa de 96 poços em triplicado por condição de tratamento.
Em seguida, em uma vez 10 a 5 células NK humanas em 100 microliters de cultura média para cada poço de células-alvo e colocar a placa na incubadora de cultura celular por quatro horas. Após o término da incubação, capture pelo menos 10 diferentes campos de imagens das células positivas de calcein AM para cada réplica de cada condição de tratamento em um microscópio de fluorescência a uma ampliação de 10 vezes. Então calcule a por cento de citotoxicidade usando a fórmula.
Para medir a migração celular NK em resposta aos estímulos quimotactic coletar células NK humanas de uma cultura 70-80% confluente e suspender as células a uma concentração média de cultura celular NK 2,5 vezes 10 vezes 10 a 6. Em seguida, adicione 600 microliters de meio livre de soro contendo a quimio da célula NK atraindo interesse por poço e coloque uma inserção de cultura de 6,5 milímetros de diâmetro com cinco poros de micrômetros em cada poço de meio. Em seguida, adicione 100 microliters de células NK ao compartimento superior de cada inserção e coloque a placa na incubadora de cultura celular por quatro horas.
No final da transferência de incubação, todo o volume de células migradas não aderentes da parte inferior de cada poço para tubos FACS individuais de cinco mililitros e adiciona 50 microliters de um número predeterminado de citometria de fluxo contando contas a cada tubo. Em seguida, usando um citómetro de fluxo avalie cada amostra celular de acordo com protocolos de análise citométrica de fluxo padrão e calcule o número absoluto de células NK migradas usando a fórmula. O knockdown atf4 reduz significativamente a citotoxicidade mediada por células NK em comparação com as células NK que expressam RNA de grampo curto não específico.
Após a coloração com calcein AM, o número de células viáveis do câncer de fígado humano diminui após a co-cultura com células NK humanas em comparação com células cancerígenas do fígado humano cultivadas sem células NK. Como esperado, o knockdown atf4 via RNA de grampo de cabelo curto reduz a morte mediada por células NK de células humanas cancerosas, como evidenciado por um maior número de células am-positivas calcein nessas culturas. Além disso, uma quantidade significativamente maior de migração de células NK é observada em resposta ao meio contendo quimioterapia em comparação com células NK expostas ao meio de controle sem quimioterapia.
Para a citotoxicidade celular NK avaliar é importante padronizar nosso esforço e relação-alvo e tempo de incubação para cada linha celular cancerosa. Uma vez que as normas são identificadas e validadas, a avaliação in vitro é complementada com experimentos de camundongos in vivo para avaliar ainda mais seu papel na erradicação de células tumorais.
