يسمح بروتوكولنا بإنشاء أنزيمات تقييد مع خصائص تسلسلية معدلة وأكثر صرامة باستخدام التقسيم في المختبر واستراتيجية اختيار فريدة في التطور الموجه. يحتمل أن يكون عالميًا تمامًا ، حيث يجب أن يكون قابلاً للتطبيق على أي قيود endonuclease ويمكن توجيه الاختيار نحو أي إصدار أكثر صرامة من تسلسل cognate الأصلي. إذا تم التعبير عن المتغيرات المنشأة حديثاً عن طريق الترجمة الحرفية في المختبر، فإن البروتوكول مناسب ليس فقط لتضييق التحديد، ولكن أيضًا لتغيير خصوصية.
لتحديد مواقع الطفرات دون التشبع، اختر ترددات الطفرات وفقا للأهمية الافتراضية للمواقع، مع الحفاظ على حدود على تعقيد المكتبة الشاملة في الاعتبار. لبدء التوليف، إدراج الأعمدة التي تم معبأة مع راتنج جديدة في المزج. توليف أوليجنوكليوتيدات في جميع الأعمدة حتى الثلاثية، مباشرة قبل موقع الطفرات الفرعية الثانية العد من نهاية ثلاثة رئيس.
توليف، وترك مجموعة trityl خمسة رئيس في نهاية المطاف. ستتم إزالة المجموعة الحماية في بداية دورة التوليف القادمة. فتح أعمدة التوليف وطاردة مركزية لفترة وجيزة في أنابيب جافة 1.5 ملليلتر لجمع الراتنج.
سحب دعم التوليف CPG ومزيج من دوامة. إعادة تقسيم الراتنج CPG مختلطة إلى أعمدة توليف جديدة. تجنب إدخال الرطوبة لأنها سوف تقلل من العائد العام.
مواصلة التوليف، بدءا من موقع الطفرات دون التشبع الثلاثي. تعيين أعمدة إلى ثلاثة توائم عشوائية NNS أو ثلاثة توائم من النوع البري وفقا لتردد الطفرات المطلوبة. إذا كانت هناك مواقع إضافية دون التشبع، انتقل فقط إلى الثلاثي الذي يسبق موقع الطفرات الفرعية التالية.
إذا لم يكن هناك المزيد من المواقع دون التشبع موجودة في المصب، واستكمال التوليف، وترك مجموعة trityl خمسة رئيس في نهاية المطاف. استخدام نصائح الماصات تتحمل واسعة لإعداد خليط النفط السطحي عن طريق إضافة 225 ميكرولترات من سبان 80 و 25 ميكرولترات من توين 80 إلى خمسة ملليلتر من النفط المعدني في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. تخلط جيدا عن طريق انعكاس لطيف 15 مرة.
وينبغي أن يكون الخليط في هذه الخطوة شفافة. لكل مكتبة، نقل 950 ميكرولترات من خليط النفط السطحي إلى قارورة قارورة قارورة قاعية مستديرة مليلتر. تسمية مع اسم مكتبة ونقلها إلى الجليد.
وضع شريط واحد صغير التحريك أسطواني في كل قارورة. إعداد في المختبر النسخ في الترجمة النسخ التفاعل الخليط وفقا لاقتراحات الشركة المصنعة. تكملة الخليط مع كلوريد المغنيسيوم إلى تركيز النهائي من 1.5 ميليمولار.
Dispense 50 ميكرولتر aliquots من خليط التفاعل في 1.5 ملليلتر أنابيب على الجليد. إضافة 1.7 femtomoles من المكتبة إلى خليط التفاعل على الجليد. إعداد مستحلب الماء في الزيت على التوالي لكل مكتبة عن طريق وضع أول منقار صغير مملوءة بالثلج على مُنشر مغناطيسي مع سرعة التحريك التي تم تعيينها إلى 1150 دورة في الدقيقة.
ثم نقل قارورة المبردة مع 950 ميكرولتردات من خليط النفط السطحي وشريط صغير معزّز إلى منقار بارد على المُنقل المغناطيسي. تحقق من أن شريط التحريك يدور. إضافة خمسة 10 ميكرولتر aliquots من مكتبة في المختبر النسخ الترجمة خليط على مدى فترة دقيقتين في 30 فترات ثانية والاستمرار في اثارة لمدة دقيقة إضافية.
نقل القارورة مع مستحلب إلى حاوية الجليد. عند هذه النقطة، يجب أن يكون السائل مبهمًا وليس شفافًا. ثم، تابع المكتبة التالية.
بعد أن تتم معالجة جميع المكتبات، بدء حضانة جميع المكتبات وفقا لتوصيات الشركة المصنعة للطقم. نقل قارورة إلى درجة الحرارة المثلى لالهندسة endonuclease لمدة ساعتين إضافية قبل وضعها على الجليد لمدة 10 دقائق على الأقل. نقل المستحلبات من قوارير التبريد في أنابيب 1.5 ملليلتر.
إضافة ميكرولتر واحد من 5 EDTA المول. وطرد مركزي لهم في 13،000 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إذا بعد الطرد المركزي لا يمكنك أن ترى واجهة الماء والنفط بوضوح، وتجميد الخليط قبل الطموح من مرحلة النفط العلوي.
نقل مرحلة الزيت العلوي مع ماصة والتخلص منها. قم بإجراء الاستخراج على الفور عن طريق إضافة 150 ميكرولترات من كلوروفورم الفينول و100 ميكرولترات من 10 ملليمولار تريس-HCl إلى المرحلة مائي. دوامة ثم تنفيذ فصل المرحلة عن طريق الطرد المركزي 30 ثانية في 13، 000 مرات ز.
جمع المرحلة مائي العلوي. عجل الحمض النووي عن طريق إضافة 15 ميكرولترات من خلات الصوديوم ثلاثة المولار، 2.5 إلى خمسة ميكروغرام من الجليكوجين، و 375 ميكرولترات من الإيثانول. بعد احتضان العينات في ناقص 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 13،000 مرات ز، أربع درجات مئوية.
تجاهل عظمى وغسل لفترة وجيزة بيليه مع ملليلتر واحد من الباردة 70٪ الإيثانول. تجفيف بيليه الجليكوجين الحمض النووي في سرعة vac أو مجفف الهواء لأكثر من خمس دقائق. ثم حل بيليه في 50 ميكرولترات من 10 ملليمولار تريس-HCl.
المقبل، إضافة خمسة ميكرولترات من الخرز المغناطيسي streptavidin، أعدت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مزيج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ويفضل في خلاط دواميل أو عن طريق دوامة لطيف. نقل الأنابيب إلى موقف مغناطيسي لفصل الخرز.
ثم جمع السائل المخصب في الحمض النووي دون البيوتين. هذا البروتوكول هو أداة لزيادة وتيرة المتغيرات المطلوبة من endonucleases تقييد المهندسة عن طريق استنزاف الانزيمات غير النشطة endonucleases مع عدم تغيير نوعية تسلسل من نوع البرية. يمكن أن يحدد الفحص الناجح ما يصل إلى 20٪ من المتغيرات الواعدة.
وتوصف المتغيرات بأنها متغيرات واعدة إذا أنتجت نمطاً من الانقسام يختلف عن الإنزيم البري. كما يتم تصنيف المتغيرات التي قد تكون قد غيرت تفضيلات التسلسل. يظهر هنا هو فحص غير ناجحة مع غالبية التباين غير نشط ومتغير واحد مع نمط الانقسام على ما يبدو دون تغيير.
في هذه الحالة، المكتبات هي الأكثر المحتمل dominated بواسطة المتغيرات غير النشطة التي escaped خطوة اختيار التقاط streptavidin. ومن الأهمية بمكان أن يتم بعناية تصميم التسلسلات المختارة والمواعدة، والحد من تنوع المكتبة باستراتيجية الطفرات التي تولد بدائل في عدد قليل فقط من المناصب المختارة. وينبغي أن تتميز أفضل المتغيرات المختارة بدقة للربط والانقسامات الحركية على تسلسلات المفضلة وليس مشقوق استنادا إلى النتائج من الفحص الأولي.
في حالة الاختبار الخاصة بنا، تم اختيار مواقع الطفرات بناءً على نموذج homology. ومن المدهش أن هيكل الكريستال في وقت لاحق أظهرت أن بعض المخلفات المعدلة هي على الأرجح ليست على اتصال مباشر مع الحمض النووي.
