Наш протокол позволяет создавать ферменты ограничения с измененными, более строгими специфичности последовательности, используя в пробирке разобщенности и уникальную стратегию отбора в направленной эволюции. Потенциально он является довольно универсальным, так как он должен быть применим к любому ограничению эндонуклеазы и выбор может быть направлен на любой более строгий вариант оригинальной последовательности cognate. Если вновь созданные варианты выражены в пробирке транскрипции-перевода, протокол подходит не только для сужения специфики, но и для изменения специфики.
Чтобы определить места для субатурации мутагенез, выберите частоты мутагенеза в соответствии с гипотетической важности сайтов, сохраняя ограничения на общую сложность библиотеки в виду. Чтобы начать синтез, вставьте столбцы, которые были упакованы с новой смолой в синтезатор. Синтезировать олигонуклеотиды во всех столбцах до триплета, непосредственно предшествующих второму поднасыщению мутагенезного участка, подсчитывая с трех-премьер-конца.
Синтезировать, оставляя пять премьер тритил группы в конце. Защитная группа будет удалена в начале следующего цикла синтеза. Откройте столбцы синтеза и кратко центрифугу в сухие 1,5 миллилитровые трубки для сбора смолы.
Потяните поддержку синтеза CPG и смешайте вихрем. Повторное разделение смешанной смолы CPG на новые столбцы синтеза. Избегайте введения влажности, поскольку это уменьшит общую урожайность.
Продолжить синтез, начиная с субатурации мутагенез сайт триплет. Назначьте столбцы рандомизированным тройняшкам НСН или тройняшкам дикого типа в соответствии с желаемой частотой мутагенеза. Если присутствуют дополнительные участки субнасыщения, переходите только к триплету, предшествующему следующему участку субатурации мутагенеза.
Если ниже по течению больше нет мест субатурации, завершите синтез, оставив в конце группу тритила в пять премьеров. Используйте широкие советы скважины пипетки для подготовки смеси масло серфактант, добавив 225 микролитров Span 80 и 25 микролитров Tween 80 до пяти миллилитров минерального масла в 15 миллилитров конической трубки. Тщательно смешайте с помощью нежной инверсии 15 раз.
Смесь на этом этапе должна быть полупрозрачной. Для каждой библиотеки перенесите 950 микролитров смеси масляного сурфактанта на двухми миллилитров круглый нижний криогенный флакон. Этикетка с библиотечным названием и переносом на лед.
Положите один небольшой цилиндрический перемешивания бар в каждом флаконе. Подготовь смесь реакции транскрипции и перевода in vitro в соответствии с предложениями производителя. Дополните смесь хлоридом магния до конечной концентрации 1,5 миллимолара.
Вылейте 50 микролитровых алицитов реакционной смеси в 1,5 миллилитровые трубки на льду. Добавьте 1,7 фемтомолы библиотеки в реакционной смеси на льду. Подготовка воды в масле эмульсии последовательно для каждой библиотеки, сначала поместив небольшой стакан, наполненный льдом на магнитном мешалке с перемешиванием скорость установлена до 1150 об /мин.
Затем перенесите криогенный флакон с 950 микролитров смеси масляного сурфактанта и небольшой перемешивание бар на ледяной стакан на магнитном мешалке. Убедитесь, что перемешивание бар вращается. Добавьте пять 10-микролитровых алицитов смеси транскрипции-перевода библиотеки in vitro в течение двух минут с интервалом в 30 секунд и продолжайте перемешивание в течение дополнительной минуты.
Перенесите флакон с эмульсией в ледяной контейнер. На данный момент жидкость должна быть непрозрачной, а не полупрозрачной. Затем перейти к следующей библиотеке.
После того, как все библиотеки будут обработаны, начните инкубацию всех библиотек в соответствии с рекомендациями производителя комплектов. Перенесите флаконы на оптимальную для инженерии эндонуклеазу температуру еще на два часа, прежде чем выставить их на лед не менее чем на 10 минут. Перенесите эмульсии из криогенных флаконов в 1,5 миллилитровые трубки.
Добавьте один микролитер из 5 молярных EDTA. И центрифугировать их при температуре 13 000 раз в течение пяти минут при комнатной температуре. Если после центрифугирования вы не можете видеть интерфейс воды и масла ясно, заморозить смесь до аспирации верхней фазы масла.
Перемести верхнюю масляную фазу с помощью пипетки и выбросьте. Немедленно выполняем экстракции, добавляя 150 микролитров фенола хлороформа и 100 микролитров 10 миллимоляров Tris-HCl к аквеозной фазе. Вихрь, а затем выполнить фазовое разделение через 30-секундную центрифугу в 13 000 раз г.
Соберите верхнюю aqueous фазу. Осадок ДНК, добавив 15 микролитров трехмолярного ацетата натрия, от 2,5 до 5 микрограммов гликогена и 375 микролитров этанола. После инкубации образцов при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение одного часа центрифуга в течение 15 минут при температуре 13 000 г, четыре градуса по Цельсию.
Откажитесь от супернатанта и кратко вымойте гранулы одним миллилитром холодного 70%этанола. Высушите гранулы гликогена ДНК в скорости вакуума или сушилки воздуха в течение более пяти минут. Затем растворите гранулы в 50 микролитров 10 миллимолейных Tris-HCl.
Далее добавьте пять микролитров стрептавидина магнитных бусин, подготовленных по указанию производителя. Смешайте в течение одного часа при комнатной температуре, предпочтительно в смеситель карусели или нежным вихрем. Перенесите трубки на магнитную подтяго, чтобы отделить бисер.
Затем соберите жидкость, обогащенную ДНК без биотина. Этот протокол является инструментом для увеличения частоты желаемых вариантов инженерии ограничения эндонуклейсов путем истощения неактивных ферментов и эндонуклейсов с неизменной специфичностью последовательности дикого типа. Успешный скрининг может выявить до 20% перспективных вариантов.
Варианты помечены как перспективные варианты, если они производят расщепление шаблон отличается от фермента дикого типа. Варианты, которые могли бы изменить предпочтение последовательности, также помечены. Здесь показан неудачный скрининг с большинством дисперсии неактивным и один вариант с по-видимому безальтернативной модели расщепления.
В этом случае в библиотеках, скорее всего, преобладают неактивные варианты, которые избежали шага выбора захвата стрептавидина. Крайне важно тщательно разработать отобранные и встречные последовательности и ограничить разнообразие библиотек стратегией мутагенеза, которая генерирует замены лишь в нескольких выбранных позициях. Наилучшие выбранные варианты должны быть тщательно охарактеризованы для связывания и расщепления кинетики на предпочтительных, а не расщепленных последовательностях на основе результатов первоначального скрининга.
В нашем тестовом случае сайты мутагенеза были выбраны на основе гомологической модели. Удивительно, но кристаллическая структура позже показала, что некоторые измененные остатки, скорее всего, не находятся в прямом контакте с ДНК.
