당사의 프로토콜은 체외 구획화와 지향 진화의 독특한 선택 전략을 사용하여 변경되고 보다 엄격한 서열 특이성을 가진 제한 효소를 생성할 수 있게 합니다. 잠재적으로 그것은 매우 보편적이다, 그것은 어떤 제한 엔토뉴리스에 적용해야하고 선택은 원래 의 cognate 시퀀스의 더 엄격한 버전으로 지시 할 수 있습니다. 새로 생성된 변형이 시험관 내 전사 변환에 의해 표현되는 경우, 프로토콜은 특이성을 좁히는 것뿐만 아니라 특이성을 변경하는 데도 적합합니다.
하위 돌연변이 발생에 대한 사이트를 결정하려면 사이트의 가상의 중요성에 따라 돌연변이 발생 주파수를 선택하여 전체 라이브러리 복잡성을 제한합니다. 합성을 시작하려면 신디사이저에 새 수지로 포장 된 열을 삽입합니다. 모든 컬럼에서 올리고뉴클레오티드를 삼중까지 합성하고, 바로 앞의 제2절 돌연변이 발생 부위가 3-프라임 엔드에서 계산된다.
합성, 끝에 다섯 프라임 트리틸 그룹을 떠나. 보호 그룹은 다음 합성 주기의 시작 부분에서 제거됩니다. 합성 컬럼을 열고 간략하게 원심분리기를 건조 1.5 밀리리터 튜브로 열어 수지를 수집합니다.
CPG 합성 지지대를 당기고 소용돌이에 섞습니다. 혼합 CPG 수지의 새 합성 열로 다시 분할합니다. 전체 수율을 감소시킬 수 있기 때문에 습도를 도입하지 마십시오.
식도 돌연변이 발생 부위삼중에서 시작하여 합성을 계속한다. 원하는 돌연변이 발생 주파수에 따라 무작위 NNS 삼중항 또는 야생형 삼중항에 컬럼을 할당합니다. 추가 하위 영역이 있는 경우 다음 하위 돌연변이 발생 부위 앞에 있는 삼중으로만 진행합니다.
더 이상 하위 화 사이트가 다운스트림이 없는 경우 합성을 완료하여 5프라임 트리틸 그룹을 종료합니다. 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 15 밀리리터 원뿔 튜브에 Span 80 및 25 마이크로리터의 Span 80 및 25 마이크로리터를 추가하여 오일 계면활성제 혼합물을 준비합니다. 부드러운 반전으로 15번 충분히 섞으세요.
이 단계의 혼합물은 반투명해야합니다. 각 라이브러리에 대해 오일 계면활성제 혼합물의 950 마이크로리터를 2밀리리터 원형 극저온 바이알로 옮기. 라이브러리 이름으로 레이블을 지정하고 얼음으로 옮김합니다.
각 유리병에 작은 원통형 교반 바 하나를 넣습니다. 제조업체의 제안에 따라 시험관 내 전사 번역 반응 혼합물을 준비합니다. 염화 마그네슘과 혼합물을 1.5 밀리몰러의 최종 농도로 보충합니다.
반응 혼합물의 50 마이크로리터 알리쿼트를 얼음 에 1.5 밀리리터 튜브에 분배합니다. 얼음에 반응 혼합물에 라이브러리의 1.7 펨토몰을 추가합니다. 1150 RPM으로 설정된 교반 속도와 함께 자기 교반기에 얼음으로 채워진 작은 비커를 먼저 배치하여 각 라이브러리에 대해 물 오일 에멀젼을 연속적으로 준비합니다.
그런 다음 950 마이크로리터의 오일 계면활성제 혼합물과 작은 교반 바를 자기 교반기의 얼음 차가운 비커로 옮기는 극저온 바이알을 전달합니다. 교반 바가 회전하고 있는지 확인합니다. 시험관 내 라이브러리 전사 번역 혼합물의 5개의 10 마이크로리터 알리쿼트를 30초 간격으로 2분 동안 추가하고 추가 1분 동안 계속 저어줍니다.
에멀젼으로 바이알을 얼음 용기로 옮는다. 이 시점에서 액체는 반투명이 아니라 불투명해야 합니다. 그런 다음 다음 라이브러리를 진행합니다.
모든 라이브러리가 처리된 후 키트 제조업체의 권장 사항에 따라 모든 라이브러리의 인큐베이션을 시작합니다. 바이알을 엔지니어링 된 엔도누셀에 최적 온도로 옮기고 2 시간 이상 얼음위에 놓습니다. 극저온 바이알에서 에멀젼을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기.
5 개의 어금니 EDTA의 마이크로 리터 1 개를 추가하십시오. 그리고 원심 분리는 실온에서 5 분 동안 13, 000 배 g로 분리합니다. 원심 분리 후 물 오일 인터페이스를 명확하게 볼 수 없다면 상부 오일 위상의 포부 전에 혼합물을 동결하십시오.
파이펫으로 상부 오일 위상을 이동하고 폐기합니다. 페놀 클로로폼 150마이크로리터와 10밀리머 트리스-HCl의 100마이크로리터를 수성상에 첨가하여 즉시 추출을 수행합니다. 소용돌이 및 13, 000 배 g에서 30 초 원심 분리를 통해 위상 분리를 수행합니다.
상부 수성 단계를 수집합니다. 3-어금니 아세테이트 15마이크로리터, 글리코겐 2.5~5마이크로그램, 에탄올 375마이크로리터를 첨가하여 DNA를 침전시합니다. 샘플을 영하 20도에서 1시간 동안 배양한 후, 원심분리기는 13, 000배, 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리기를 사용한다.
상체를 버리고 차가운 70 %의 에탄올 1 밀리리터로 펠릿을 간략하게 씻으십시오. DNA 글리코겐 펠릿을 고속 진공 또는 공기 건조기에서 5분 이상 건조시킵니다. 그런 다음 10 밀리머 트리스-HCl의 50 마이크로 리터에 펠릿을 용해.
다음으로 제조업체의 지시에 따라 준비된 5개의 스티르타비딘 마그네틱 비즈를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 섞거나, 바람직하게는 회전 목마 믹서나 부드러운 소용돌이에 섞는다. 튜브를 자기 스탠드로 옮겨 구슬을 분리합니다.
그런 다음 비오틴없이 DNA에 농축 된 액체를 수집합니다. 이 프로토콜은 변경되지 않은 야생 형 서열 특이성으로 비활성 효소 및 엔도뇌리스를 고갈시킴으로써 설계 된 제한 엔토나크리스의 원하는 변이체의 주파수를 증가시키는 도구입니다. 성공적인 심사는 유망한 변종의 최대 20%를 식별할 수 있습니다.
변이체는 야생식 효소와 구별되는 분열 패턴을 생성하는 경우 유망한 변형으로 표시됩니다. 시퀀스 기본 설정을 변경했을 수 있는 변형도 레이블이 지정됩니다. 여기에 표시 분산 비활성 의 대부분과 분명히 변경되지 않은 분열 패턴을 가진 하나의 변종과 실패 한 검사입니다.
이 경우 라이브러리는 스트렙타비딘 캡처 선택 단계를 벗어난 비활성 변형에 의해 지배될 수 있습니다. 선택한 및 반대로 선택된 시퀀스를 신중하게 설계하고 선택한 몇 개 위치에서만 대체를 생성하는 돌연변이 발생 전략에 따라 라이브러리 다양성을 제한하는 것이 중요합니다. 선택된 최상의 변종은 초기 스크리닝의 결과에 기초하여 선호되고 절단된 시퀀스가 아닌 결합 및 분열 역학을 위해 철저히 특성화되어야 한다.
우리의 시험 케이스에서, 돌연변이 발생 사이트는 상동성 모형에 근거하여 선택되었습니다. 놀랍게도, 결정 구조는 나중에 몇몇 변경한 잔류물이 DNA와 직접 접촉하지 않다는 것을 보여주었습니다.
