Il nostro protocollo consente la creazione di enzimi di restrizione con specificità di sequenza alterate e più rigorose utilizzando la compartimentazione in vitro e una strategia di selezione unica nell'evoluzione diretta. Potenzialmente è abbastanza universale, in quanto dovrebbe essere applicabile a qualsiasi restrizione endonucleasi e la selezione può essere diretta verso qualsiasi versione più rigorosa di una sequenza affini originale. Se le varianti appena create sono espresse dalla trascrizione-traduzione in vitro, il protocollo è adatto non solo per restringere la specificità, ma anche per alterare la specificità.
Per decidere i siti per la mutagenesi della subsaturazione, scegliere le frequenze di mutagenesi in base all'ipotetica importanza dei siti, tenendo a mente i limiti della complessità complessiva della libreria. Per iniziare la sintesi, inserire colonne che sono state imballate con nuova resina nel sintetizzatore. Sintetizzare oligonucleotidi in tutte le colonne fino alla tripletta, immediatamente prima del secondo sito di mutagenesi subsaturazione contando dall'estremità dei tre primi.
Sintetizzare, lasciando un gruppo trityl a cinque primi alla fine. Il gruppo protettivo verrà rimosso all'inizio del prossimo ciclo di sintesi. Aprire le colonne di sintesi e centrifugare brevemente in tubi asciutti da 1,5 millilitri per raccogliere la resina.
Tirare il supporto di sintesi CPG e mescolare con vortici. Ripartizionare la resina CPG mista in nuove colonne di sintesi. Evitare di introdurre umidità perché diminuirà la resa complessiva.
Continuare la sintesi, partendo dalla tripletta del sito di mutagenesi subsaturazione. Assegnare colonne a terzine NNS randomizzate o terzine di tipo selvaggio in base alla frequenza di mutagenesi desiderata. Se sono presenti ulteriori siti di subsaturazione, procedere solo alla tripletta che precede il successivo sito di mutagenesi della subsaturazione.
Se non sono presenti più siti di subsaturazione a valle, completare la sintesi, lasciando un gruppo tritipo a cinque primi alla fine. Utilizzare punte di pipetta a foro largo per preparare una miscela di tensioattivi di olio aggiungendo 225 microlitri di Span 80 e 25 microlitri di Tween da 80 a cinque millilitri di olio minerale in un tubo conico da 15 millilitri. Mescolare accuratamente con un'inversione delicata 15 volte.
La miscela in questo passaggio dovrebbe essere traslucida. Per ogni libreria, trasferire 950 microlitri della miscela di tensioattivi ad olio in una fiala criogenica rotonda a due millilitri. Etichetta con il nome di una biblioteca e trasferimento sul ghiaccio.
Mettere una piccola barra cilindrica di agitazione in ogni flaconcino. Preparare una miscela di reazione traslazione-traduzione in vitro secondo i suggerimenti del produttore. Integrare la miscela con cloruro di magnesio ad una concentrazione finale di 1,5 millimolare.
Distribuire 50 aliquote microliter della miscela di reazione in tubi da 1,5 millilitri su ghiaccio. Aggiungere 1,7 femtomoli della libreria alla miscela di reazione sul ghiaccio. Preparare l'emulsione acqua-in-olio consecutivamente per ogni libreria posizionando prima un piccolo bicchiere riempito di ghiaccio su un agitatore magnetico con la velocità di agitazione impostata su 1150 giri/min.
Quindi trasferire una fiala criogenica con 950 microlitri di miscela di tensioattivi ad olio e una piccola barra di agitazione su un becher ghiacciato sull'agitatore magnetico. Controllare che la barra di agitazione sta girando. Aggiungere cinque aliquote da 10 microliter della miscela traslazione-traslazione della libreria in vitro per un periodo di due minuti a intervalli di 30 secondi e continuare a mescolare per un minuto aggiuntivo.
Trasferire il flaconcino con l'emulsione in un contenitore di ghiaccio. A questo punto, il liquido dovrebbe essere opaco, non traslucido. Quindi, procedere con la libreria successiva.
Dopo che tutte le librerie sono state elaborate, avviare l'incubazione di tutte le librerie secondo le raccomandazioni del produttore del kit. Trasferire i flaconcini alla temperatura ottimale per l'endonucleasi ingegnerizzata per altre due ore prima di metterli sul ghiaccio per almeno 10 minuti. Trasferire le emulsioni dalle fiale criogeniche in tubi da 1,5 millilitri.
Aggiungere un microlitro di 5 EDTA molare. E centrifugarli a 13.000 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Se dopo la centrifugazione non è possibile vedere chiaramente l'interfaccia acqua-olio, congelare la miscela prima dell'aspirazione della fase superiore dell'olio.
Spostare la fase superiore dell'olio con una pipetta e scartare. Eseguire immediatamente l'estrazione aggiungendo 150 microlitri di cloroformio fenolo e 100 microlitri di Tris-HCl millimolare alla fase acquosa. Vortice e quindi eseguire la separazione di fase tramite centrifugazione di 30 secondi a 13.000 volte g.
Raccogli la fase acquosa superiore. Precipitare il DNA aggiungendo 15 microlitri di acetato di sodio trimolare, da 2,5 a cinque microgrammi di glicogeno e 375 microlitri di etanolo. Dopo aver incubato i campioni a meno 20 gradi Celsius per un'ora, centrifugare per 15 minuti a 13.000 volte g, quattro gradi Celsius.
Scartare il supernatante e lavare brevemente il pellet con un millilitro di etanolo freddo al 70%. Asciugare il pellet di glicogeno del DNA in unvac di velocità o in un essiccatore d'aria per più di cinque minuti. Quindi sciogliere il pellet in 50 microlitri di Tris-HCl da 10 millimolare.
Successivamente, aggiungere cinque microlitri di perline magnetiche streptavidin, preparati secondo le istruzioni del produttore. Mescolare per un'ora a temperatura ambiente, preferibilmente in un miscelatore carosello o con un vortice delicato. Trasferire i tubi su un supporto magnetico per separare le perline.
Quindi raccogliere il liquido arricchito in DNA senza biotina. Questo protocollo è uno strumento per aumentare la frequenza delle varianti desiderate di endonucleasi di restrizione ingegnerizzate esaurire enzimi inattivi ed endonucleasi con una specificità di sequenza di tipo selvatico invariata. Lo screening riuscito può identificare fino al 20% delle varianti promettenti.
Le varianti sono etichettate come varianti promettenti se producono un modello di scissione distinto dall'enzima di tipo selvatico. Vengono etichettate anche le varianti che potrebbero aver modificato la preferenza di sequenza. Qui è mostrato uno screening senza successo con la maggior parte della varianza inattiva e una variante con schema di scissione apparentemente inalterato.
In questo caso, le librerie sono molto probabilmente dominate da varianti inattive sfuggite al passaggio di selezione dell'acquisizione streptavidin. È fondamentale progettare attentamente le sequenze selezionate e controsele selezionate e limitare la diversità della libreria mediante la strategia di mutagenesi che genera sostituzioni in poche posizioni selezionate. Le migliori varianti selezionate devono essere accuratamente caratterizzate per legare e scollaturare la cinetica su sequenze preferite e non scisse in base ai risultati dello screening iniziale.
Nel nostro test case, i siti di mutagenesi sono stati selezionati sulla base di un modello di omologia. Sorprendentemente, una struttura cristallina in seguito mostrò che alcuni residui alterati molto probabilmente non sono a diretto contatto con il DNA.
