يستخدم علم المناعة على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية لتحديد موقع البروتين من الفائدة. يمكن الكشف عن مناعة متعددة متعددة أهداف متعددة على نفس العينة باستخدام أجسام مضادة أولية مختلفة. وتتمثل فائدة هذه الطريقة في استخدام المخازن المؤقتة المتاحة عادة للقضاء على نشاط الأجسام المضادة الذي يسمح بالمناعة باستخدام جسمين أو أكثر من الأجسام المضادة الأولية غير المُسمَّاة من نفس الأنواع المضيفة.
ومن خلال هذا الإجراء، ستكون صوفيا تشنغ، طالبة الدراسات العليا، وتشيونغشيا ليو، وهي باحثة زائرة في مختبري. قبل تلطيخ، دي الشمع و rehydrate الشرائح البارافين ثابتة جزءا لا يتجزأ مع الانغماس لمدة خمس دقائق في كل حل كما هو مبين. بعد الغمر الثاني للمياه المقطرة، ضع الشرائح في 275 ملليلتر من محلول سترات الصوديوم المغلي على الجزء السفلي من صندوق تلميح ماصة مع غطاء ووضع الصندوق في ميكروويف 700 واط بقدرة 75٪ لمدة ثماني دقائق.
في نهاية العلاج، افتح الغطاء واسمح للمحلول بأن يبرد في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الشرائح بثلاثة غسلات لمدة خمس دقائق من PBST الطازجة في جرة كوبلين. لمنع أي مواقع غير محددة ملزمة ، بعد آخر غسل يهز PBST الزائدة من كل شريحة وتغطية الشرائح مع حجم كاف من حل حظر المناسبة. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة، اهز محلول الحجب الزائد من كل شريحة وأضف 250 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية الأولى ذات الأهمية لكل عينة.
لمنع العينات من الجفاف، قد تكون مغطاة الشرائح من قبل قطعة من فيلم البارافين. بعد حضانة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية في غرفة مرطبة، وغسل الشرائح ثلاث مرات مع PBST الطازجة لمدة خمس دقائق لكل غسل. تخلص من PBST الزائدة ثم تغطية بسرعة كل شريحة مع 250 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لاحتضان لمدة ساعة واحدة في غرفة مرطبة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST الطازجة كما هو موضح وإضافة 250 ميكرولترات من اكرسيد الفجل streptavidin إعداد حديثا إلى كل شريحة. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST الطازجة. ثم التخلص من PBST الزائدة وتغطية كل شريحة مع 250 ميكرولترات من محلول الفلوروهور-tyramide الطازجة.
دقيقة واحدة في وقت لاحق ، غمر الشرائح في PBST الطازجة تليها ثلاثة يغسل لمدة دقيقتين في PBST الطازجة. بعد الغسيل الأخير، تطبيق بضع قطرات من واحد إلى واحد حل الجلسرين إلى برنامج تلفزيوني إلى الأقسام والتحقق من وجود إشارة الفلورانس عن طريق المجهر الفلوريسنس. لتجريد أول مركب مضاد، ضع الشرائح المسماة بالأجسام المضادة في 275 ملليلتر من محلول سيترات الصوديوم المغلي لمدة ثماني دقائق على الأقل كما هو موضح.
في نهاية العلاج، افتح الغطاء واترك الحل يبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل غسل الشرائح ثلاث مرات مع PBST لمدة خمس دقائق لكل غسل. لطخة للبروتين الهدف الثاني من الفائدة، بعد عرقلة للربط غير محددة كما هو موضح، تسمية كل عينة مع 250 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية الثانية من الفائدة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، غسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في PBST الطازجة في غسل قبل تغطية كل شريحة مع 250 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST الطازجة كما هو موضح وإضافة 250 ميكرولترات من اكرسيد الفجل streptavidin إعداد حديثا إلى كل شريحة. لتطوير إشارة للبروتين الهدف الثاني من الفائدة، بعد ثلاثة يغسل PBST، علاج الشرائح مع تيراميد الفلورو مترافق في طيف فلوري مختلف. لوقف تطوير إشارة tyramide ، submerge الشرائح في PBST.
ثم وصمة العينات مع صبغة نووية مناسبة. للتصوير عن طريق المجهر الفلوريسنس، جبل كل صبغة نووية تسمية الشريحة مع قطرة من وسيلة تركيب مناسبة في غطاء. استخدام الهدف 4X لتحديد مكان الأنسجة على الشريحة.
قم بالتبديل إلى الهدف 10X للتصوير وضبط وقت التعرض إلى 100 إلى 400 مللي ثانية مع مصدر الضوء بين 40 إلى 80٪ شدة. ثم الحصول على الصور في كل قناة دون تحريك المرحلة. يمكن دمج الصور من كل قناة لتشكيل صورة فلورية متعددة.
دون تجريد بين تلطيخ الأجسام المضادة الأولى والثانوية ، فإن التلطخ الثاني للهيدروكسيل التيروزين سيلتقط إشارات من البروتين المستهدف الأول من الاهتمام مما يؤدي إلى تلطيخ هيدروكسيلاسي إيجابي زائف ، على سبيل المثال في هذه العينة داخل قشرة الغدة الكظرية. لإزالة الأجسام المضادة عبر النشاط في بيروكسيديز الفجل من أول مناعي، يمكن إجراء تجريد لمدة دقيقة وثماني دقائق بواسطة الميكروويف مما يؤدي إلى نتائج تلوين مزدوجة نظيفة. يتم التقاط أي إشارة هامة في عينات التحكم السلبية.
تجريد لمدة ثماني دقائق في عازلة سيترات الغليان هو أيضا كافية للقضاء على الأجسام المضادة عبر التفاعل للعديد من الأجسام المضادة المستخدمة عادة في الغدة الكظرية. في بعض الحالات، إشارة إيجابية كاذبة ضعيفة لا يزال يمكن الكشف عنها، ومع ذلك، وزيادة 20 دقيقة لمعالجة الميكروويف لا يزال قد لا إزالة تماما الأجسام المضادة عبر التفاعل. أثناء التصوير المفلور، من المهم عدم تحريك المرحلة عند تبديل القنوات.
ومع ذلك، قد يكون من الضروري إعادة ضبط التركيز للحصول على صور واضحة لكل قناة. لكل قناة، تأكد من ضبط وقت التعرض للتأكد من أن الإشارات مكشوفة بشكل مناسب بدون وحدات بكسل أو مناطق مكشوفة في الصور. أثناء إجراء تلطيخ، من المهم للحفاظ على الشرائح رطب من إزالة الصبح والشرائح يمكن تجريدها باستخدام نفس أساليب تجريد عدة مرات للسماح تلطيخ متعددة.
