면역 염색은 관심있는 단백질의 위치를 확인하기 위해 생체 의학 연구에서 널리 사용됩니다. 멀티플렉스 면역스테인링은 상이한 1차 항체를 사용하여 동일한 샘플에서 여러 표적을 검출할 수 있다. 이 방법의 장점은 항체 교차 반응성을 제거하기 위해 일반적으로 이용 가능한 완충제의 사용으로 동일한 숙주 종으로부터 두 개 이상의 라벨이 없는 1차 항체를 사용하여 면역스테인링을 허용하는 것이다.
이 절차를 시연하는 것은 대학원생인 소피아 정과 제 연구실방문학자 인 치옹시아 루(Qiongxia Lyu)가 될 것입니다. 염색하기 전에, 탈왁스및 각 솔루션에 5분 몰입이 있는 포르말린 고정 파라핀 임베디드 슬라이드를 재수화합니다. 두 번째 증류수 침수 후, 슬라이딩을 뚜껑이 있는 파이펫 팁 박스 바닥에 끓는 나트륨 구연산용액 275밀리리터에 넣고 8분 동안 75%의 전력으로 상자를 700와트 마이크로파에 넣습니다.
치료가 끝나면 뚜껑을 열고 코플린 항아리에 신선한 PBST 3 분 세척으로 슬라이드를 세척하기 전에 용액을 실온으로 식힙니다. 비특이적 결합 부위를 차단하려면 마지막 세척 후 각 슬라이드에서 초과 PBST를 흔들고 적절한 차단 솔루션의 충분한 부피로 슬라이드를 덮습니다. 가습 챔버에서 실온에서 30 분 후, 각 슬라이드에서 초과 차단 용액을 흔들고 각 샘플에 관심의 첫 번째 기본 항체의 250 마이크로 리터를 추가합니다.
샘플이 건조되는 것을 방지하기 위해 슬라이드는 파라핀 필름조각으로 덮여 있을 수 있습니다. 가습 챔버에서 섭씨 4도에서 하룻밤 잠복 후, 세척 당 5 분 동안 신선한 PBST로 슬라이드를 세 번 세척하십시오. 여분의 PBST를 흔들어 서 면 신속 하 게 실온에서 가습 챔버에서 1 시간 배양에 대 한 적절 한 이차 항체 용액의 250 마이크로 리터와 각 슬라이드를 커버.
인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 신선한 PBST에서 세 번 세척하고 새로 준비된 스트렙타비딘 고추냉이 과로시다제 250 마이크로리터를 각 슬라이드에 추가합니다. 실온에서 30분 후, 신선한 PBST에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오. 그런 다음 초과 PBST를 흔들어 고 새로 준비 된 플루오로포레 티라미드 용액의 250 마이크로 리터로 각 슬라이드를 덮습니다.
1분 후, 신선한 PBST에 슬라이드를 잠수한 다음 신선한 PBST에서 3 개의 2 분 세차재가 뒤따릅니다. 마지막 세척 후, 섹션에 일대일 글리세롤 - PBS 용액의 몇 방울을 적용하고 형광 현미경 검사에 의해 형광 신호의 존재를 확인합니다. 첫 번째 항체 복합체를 제거하기 위해, 입증된 바와 같이, 구연산나트륨 용액의 275 밀리리터에 항체 라벨 슬라이드를 배치한다.
치료가 끝나면 뚜껑을 열고 PBST로 슬라이드를 세 번 세척하기 전에 실온으로 용액을 식힙니다. 관심있는 제 2 표적 단백질에 대한 얼룩을 위해, 입증 된 바와 같이 비특이적 결합을 차단 한 후, 각 샘플을 4섭씨에서 관심있는 제 2 차 항체의 마이크로리터로 라벨을 밤새 섭씨 4도로 표시하십시오. 다음 날 아침, 슬라이드를 세척당 신선한 PBST로 5분간 3회 세척한 후 각 슬라이드를 실온에서 1시간 배양할 수 있는 적절한 이차 항체 용액 250마이크로리터로 덮습니다.
인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 신선한 PBST에서 세 번 세척하고 새로 준비된 스트렙타비딘 고추냉이 과로시다제 250 마이크로리터를 각 슬라이드에 추가합니다. 관심있는 제 2 표적 단백질에 대한 신호를 개발하기 위해, 세 개의 PBST 세차제 후, 다른 형광 스펙트럼에서 플루오로포어 컨쥬게이드 티라미드로 슬라이드를 치료한다. 티라미드 신호 개발을 중지하려면 슬라이드를 PBST에 잠급니다.
그런 다음 적절한 핵 염료로 샘플을 얼룩지게합니다. 형광 현미경 검사법에 의한 이미징을 위해 각 핵 염료 표지 슬라이드에 적절한 장착 매체를 커버슬립에 장착하십시오. 슬라이드에서 조직을 찾기 위해 4X 목표를 사용합니다.
이미징을 위한 10X 목표로 전환하고 광원으로 40~80% 강도로 노출 시간을 100~400밀리초로 조정합니다. 그런 다음 스테이지를 이동하지 않고 각 채널에서 이미지를 가져옵니다. 각 채널의 이미지를 병합하여 멀티플렉스 형광 이미지를 형성할 수 있습니다.
제1 및 이차 항체 염색 사이에 제거하지 않고, 티로신 하이드록실라제에 대한 제2 염색은 부신 피질 내의 이 샘플에서 예를 들어, 거짓 양성 티로신 하이드록실라제 염색의 결과로 관심있는 첫 번째 표적 단백질로부터 신호를 포착합니다. 첫 번째 면역 스테인닝에서 고추냉이 과산화제에서 항체 교차 반응성을 제거하기 위해 1 분 및 8 분 마이크로파 매개 스트립이 수행되어 깨끗한 이중 염색 결과를 초래할 수 있습니다. 음의 제어 샘플에서는 중요한 신호가 포착되지 않습니다.
끓는 구연산 완충에서 8 분 스트립은 또한 부신에 일반적으로 사용되는 많은 항체에 대한 항체 교차 반응성을 제거하기에 충분하다. 어떤 경우에는 약한 거짓 양성 신호가 여전히 검출가능하지만, 마이크로파 처리로 20분 증가해도 항체 교차 반응성을 완전히 제거하지 못할 수 있다. 형광 이미징 동안 채널을 전환 할 때 단계를 이동하지 않는 것이 중요합니다.
그러나 각 채널의 선명한 이미지를 얻기 위해 초점을 재조정해야 할 수도 있습니다. 각 채널에 대해 노출 시간을 조정하여 이미지가 노출되지 않은 픽셀이나 영역없이 신호가 적절하게 노출되도록 해야 합니다. 염색 절차 동안, 탈 왁싱에서 수화 슬라이드를 유지하는 것이 중요하며 멀티 플렉스 염색을 허용하기 위해 동일한 스트리핑 방법을 여러 번 사용하여 슬라이드를 제거 할 수 있습니다.
