Иммуностимация широко используется в биомедицинских исследованиях для определения местонахождения белка, представляющих интерес. Мультиплекс иммуностимулятор может обнаружить несколько целей на одном образце с использованием различных первичных антител. Преимуществом этого метода является использование общедоступных буферов для устранения перекрестной реактивности антител, позволяющих иммуностиметь с использованием двух или более неразмещенных первичных антител от одного и того же вида-хозяина.
Демонстрацией процедуры будет София Чжэн, аспирантка, и Цёнся Лю, приглашенный ученый из моей лаборатории. Перед окрашиванием, де-воск и регидратировать формалин фиксированной парафин-встроенные слайды с пятиминутным погружением в каждом растворе, как указано. После второго дистиллированного погружения воды, поместите слайды в 275 миллилитров кипящего раствора цитрата натрия на дне коробки наконечник пипетки с крышкой и поместите коробку в микроволновую печь мощностью 700 ватт при 75%-ной мощности в течение восьми минут.
В конце лечения откройте крышку и дайте раствору остыть до комнатной температуры перед мытьем горок тремя пятиминутными стирками свежего PBST в банке Coplin. Чтобы заблокировать любые неспецифические связывающие сайты, после последней стирки встряхните излишки PBST с каждого слайда и накройте слайды достаточным объемом соответствующего блокирующего решения. После 30 минут при комнатной температуре во влажной камере встряхните избыток блокирующего раствора с каждого слайда и добавьте 250 микролитров первого первичного антитела, представляющих интерес для каждого образца.
Чтобы предотвратить высыхание образцов, слайды могут быть покрыты куском парафиновой пленки. После ночной инкубации при четырех градусах Цельсия во влажной камере, мыть горки три раза со свежим PBST в течение пяти минут за стирку. Встряхните избыток PBST затем быстро покрыть каждый слайд с 250 микролитров соответствующего вторичного раствора антител для одного часа инкубации во влажной камере при комнатной температуре.
В конце инкубации, мыть слайды три раза в свежем PBST, как попродемонстрировано, и добавить 250 микролитров свежеприготовленного стрептавидина хрена peroxidase к каждому слайду. После 30 минут при комнатной температуре, мыть горки три раза в свежем PBST. Затем стряхните лишний PBST и накройте каждый слайд 250 микролитров свежеприготовленного фторфорно-тирамидного раствора.
Минуту спустя, погрузить слайды в свежем PBST следуют три две минуты моет в свежем PBST. После последней стирки нанесите несколько капель раствора глицерол-к-PBS один на секции и проверьте наличие сигнала флуоресценции с помощью флуоресцентной микроскопии. Чтобы лишить первый комплекс антител, поместите антитела помечены слайды в 275 миллилитров кипящего раствора цитрата натрия, по крайней мере восемь минут, как попродемонстрировано.
В конце лечения откройте крышку и дайте раствору остыть до комнатной температуры перед мытьем слайдов три раза с PBST в течение пяти минут за стирку. Чтобы испачкать второй целевой белок интереса, после блокирования для неспецифической привязки, как попродемонстрировано, этикетка каждого образца с 250 микролитров второго первичного антитела интерес при четырех градусах по Цельсию в одночасье. На следующее утро, мыть слайды три раза в течение пяти минут в свежем PBST за стирку, прежде чем покрыть каждый слайд с 250 микролитров соответствующего вторичного раствора антитела для одного часа инкубации при комнатной температуре.
В конце инкубации, мыть слайды три раза в свежем PBST, как попродемонстрировано, и добавить 250 микролитров свежеприготовленного стрептавидина хрена peroxidase к каждому слайду. Для разработки сигнала для второй целевой белок интереса, после трех ПБСТ моет, лечить слайды с флюорофором конъюгированных тирамид в различных флуоресцентного спектра. Чтобы остановить развитие сигнала тирамида, погрузите слайды в PBST.
Затем испачкать образцы соответствующим ядерным красителем. Для визуализации с помощью микроскопии флуоресценции, монтировать каждый ядерный краситель помечены слайд с каплей соответствующей монтажной среды в крышке. Используйте цель 4X, чтобы найти ткани на слайде.
Переключитесь на цель 10X для визуализации и отрегулируйте время экспозиции до 100-400 миллисекунд с источником света от 40 до 80% интенсивности. Затем получить изображения в каждом канале, не перемещая сцену. Изображения с каждого канала могут быть объединены в мультиплексное флуоресцентное изображение.
Без зачистки между первым и вторичным окрашивание антител, второе окрашивание для гидроксилазы тирозина будет забрать сигналы от первого целевого белка интереса в результате ложноположительного окрашивания гидроксилазы тирозина, например, в этом образце в коре надпочечников. Для удаления антитела перекрестной реактивности в пероксидазе хрена от первого иммуностимулятора, одна минута и восемь минут микроволновой опосредовано зачистки могут быть выполнены в результате чего чистые двойные результаты окрашивания. В отрицательных контрольных пробах не подбирается какой-либо значительный сигнал.
Восьмиминутная зачистка в кипящем буфере цитратов также достаточна для устранения перекрестной реактивности антител для многих антител, обычно используемых в надпочечниках. В некоторых случаях слабый ложноположительной сигнал по-прежнему обнаруживается, однако, и увеличение на 20 минут до микроволновой обработки по-прежнему не может полностью удалить антитела перекрестной реактивности. Во время флуоресценции изображения, важно не перемещать этап при переключении каналов.
Тем не менее, может потребоваться скорректировать фокус, чтобы получить четкие изображения каждого канала. Для каждого канала, не забудьте настроить время экспозиции, чтобы убедиться, что сигналы должным образом подвергаются без переэкспонированных пикселей или областей на изображениях. Во время процедуры окрашивания, важно, чтобы сохранить слайды гидратированных от де-воска и слайды могут быть лишены с помощью тех же методов зачистки несколько раз, чтобы мультиплекс окрашивания.
