Immunostaining yaygın ilgi bir proteinin yerini belirlemek için biyomedikal araştırmalarda kullanılır. Multipleks immünboyama farklı primer antikorlar kullanarak aynı örnek üzerinde birden fazla hedef tespit edebilirsiniz. Bu yöntemin yararı, aynı konak türlerden iki veya daha fazla etiketlenmemiş birincil antikor kullanarak immünboyama sağlayan antikor çapraz reaktivite ortadan kaldırmak için yaygın olarak kullanılabilir tamponlar kullanılmasıdır.
Prosedürü gösteren Sophia Zheng, yüksek lisans öğrencisi ve Qiongxia Lyu, benim laboratuvar misafir bilim adamı olacaktır. Boyama önce, de-wax ve rehydrate formalin-sabit parafin gömülü slaytlar her çözeltide beş dakikalık daldırma ile belirtildiği gibi. İkinci distile su daldırma sonra, bir kapak ile bir pipet ucu kutusunun altına 275 mililitre kaynar sodyum sitrat çözeltisi slaytlar yerleştirin ve 8 dakika boyunca% 75 güç 700 watt mikrodalga içine kutu yerleştirin.
Tedavinin sonunda, kapağı açın ve bir Coplin kavanozda taze PBST üç beş dakikalık yıkar ile slaytlar yıkamadan önce oda sıcaklığına çözelti soğumasını bekleyin. Spesifik olmayan bağlama sitelerini engellemek için, son yıkamadan sonra her slayttaki fazla PBST'yi sallayın ve slaytları uygun bir engelleme çözeltisinin yeterli hacmiyle kapatın. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 30 dakika kaldıktan sonra, her slayttan fazla engelleme çözeltisini sallayın ve her numuneye ilgi çekici ilk birincil antikordan 250 mikrolitre ekleyin.
Örneklerin kurumasını önlemek için, slaytlar bir parça parafin film le kaplanabilir. Nemlendirilmiş bir odada dört derece santigrat bir gecede kuluçka sonra, yıkama başına beş dakika taze PBST ile slaytlar üç kez yıkayın. Fazla PBST'yi silkeleyin, oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada bir saatlik kuluçka için her slaytı 250 mikrolitre uygun ikincil antikor çözeltisi ile hızlı bir şekilde kapatın.
Kuluçka sonunda, gösterdiği gibi taze PBST slaytlar üç kez yıkayın ve her slayt taze hazırlanmış streptavidin horseradish peroksidaz 250 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, taze PBST slaytlar üç kez yıkayın. Sonra aşırı PBST kapalı sallamak ve taze hazırlanmış florofor-tiramid çözeltisi 250 mikrolitre ile her slayt kapağı.
Bir dakika sonra, taze PBST slaytlar batırın taze PBST üç iki dakikalık yıkayıyor ardından taze PBST. Son yıkamadan sonra, bölümlere bire bir gliserol-pBS çözeltisi birkaç damla uygulayın ve floresan mikroskopi ile bir floresan sinyal varlığını kontrol edin. İlk antikor kompleksini soymak için, antikor etiketli slaytları 275 mililitre kaynar sodyum sitrat çözeltisine en az sekiz dakika yerleştirin.
Tedavinin sonunda, kapağı açın ve kaydırma başına beş dakika PBST ile üç kez yıkamadan önce çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. İkinci hedef proteini lekelemek için, gösterildiği gibi nonspesifik ciltleme için bloke sonra, her örnek ile etiket 250 mikrolitre ilgi ikinci birincil antikor bir gecede. Ertesi sabah, oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için uygun bir ikincil antikor çözeltisi 250 mikrolitre ile her slayt kapsayan önce yıkama başına taze PBST beş dakika boyunca slaytlar üç kez yıkayın.
Kuluçka sonunda, gösterdiği gibi taze PBST slaytlar üç kez yıkayın ve her slayt taze hazırlanmış streptavidin horseradish peroksidaz 250 mikrolitre ekleyin. Üç PBST yıkama sonra, ilgi ikinci hedef protein için sinyal geliştirmek için, farklı bir floresan spektrumda florofor konjuge tiramid ile slaytlar tedavi. Tiramid sinyal gelişimini durdurmak için slaytları PBST'ye batırın.
Sonra uygun bir nükleer boya ile örnekleri leke. Floresan mikroskobu ile görüntüleme için, bir coverslip uygun bir montaj ortamı bir damla ile etiketli slayt her nükleer boya monte. Slayttaki dokuyu bulmak için 4X hedefini kullanın.
Görüntüleme için 10X hedefine geçin ve ışık kaynağı %40 ila %80 yoğunlukta pozlama süresini 100 ila 400 milisaniyeye ayarlayın. Sonra sahne hareket etmeden her kanalda görüntüleri elde. Her kanaldan görüntüler çokluk floresan görüntü oluşturmak için birleştirilebilir.
Birinci ve sekonder antikor boyama arasında sıyırma olmadan, tirozin hidroksilaz için ikinci boyama yanlış pozitif tirozin hidroksilaz boyama sonuçlanan ilgi ilk hedef protein sinyalleri alacak, örneğin adrenal korteks içinde bu örnekte. İlk immünboyama gelen horseradish peroksidaz antikor çapraz reaktivite kaldırmak için, bir dakika ve sekiz dakikalık mikrodalga aracılı sıyırma temiz çift boyama sonuçları ile sonuçlanan yapılabilir. Negatif kontrol örneklerinde anlamlı bir sinyal alınmaz.
Kaynama sitrat tampon sekiz dakikalık sıyırma da yaygın adrenal bezi kullanılan birçok antikorlar için antikor çapraz reaktivite ortadan kaldırmak için yeterlidir. Bazı durumlarda, zayıf bir yanlış pozitif sinyal hala tespit edilebilir, ancak, ve mikrodalga tedavisi için 20 dakikalık bir artış hala tamamen antikor çapraz reaktivite kaldırmak olmayabilir. Floresan görüntüleme sırasında, kanal değiştirirken sahneyi hareket ettirmemek önemlidir.
Ancak, her kanalın net görüntülerini elde etmek için odağı yeniden yeniden düzenlemek gerekebilir. Her kanal için, sinyallerin görüntülerde aşırı pozlanmış piksel veya alan olmadan uygun şekilde açığa alındığından emin olmak için pozlama süresini ayarladığından emin olun. Boyama işlemi sırasında, slaytlar de-waxing sulu tutmak önemlidir ve slaytlar multipleks boyama izin vermek için aynı sıyırma yöntemleri birkaç kez kullanılarak elimden alınabilir.
