L'immunostaining è ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica per identificare la posizione di una proteina di interesse. L'immunosocienza multiplex può rilevare più bersagli sullo stesso campione utilizzando anticorpi primari diversi. Il vantaggio di questo metodo è l'uso di tamponi comunemente disponibili per eliminare la reattività incrociata degli anticorpi che consente l'immunostaining utilizzando due o più anticorpi primari non etichettati della stessa specie ospite.
A dimostrare la procedura saranno Sophia Zheng, una studentessa laureata, e Qiongxia Lyu, una visiting scholar del mio laboratorio. Prima di macchiare, de-cerare e reidratare diapositive incorporate in paraffina fissa formalina con immersioni di cinque minuti in ogni soluzione come indicato. Dopo la seconda immersione in acqua distillata, posizionare gli scivoli in 275 millilitri di soluzione di citrato di sodio bollente sul fondo di una scatola di punta della pipetta con un coperchio e posizionare la scatola in un forno a microonde da 700 watt al 75% di potenza per otto minuti.
Al termine del trattamento, aprire il coperchio e lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente prima di lavare gli scivoli con tre lavaggi di cinque minuti di PBST fresco in un barattolo coplin. Per bloccare eventuali siti di rilegatura non specifici, dopo l'ultimo lavaggio scuotere il PBST in eccesso da ogni diapositiva e coprire le diapositive con un volume sufficiente di un'appropriata soluzione di blocco. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata, agitare la soluzione di blocco in eccesso da ogni diapositiva e aggiungere 250 microlitri del primo anticorpo primario di interesse per ciascun campione.
Per evitare che i campioni si asciughino, le diapositive possono essere coperte da un pezzo di pellicola di paraffina. Dopo un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius in una camera umidificata, lavare gli scivoli tre volte con PBST fresco per cinque minuti per lavaggio. Scrollarsi di mente il PBST in eccesso, quindi coprire rapidamente ogni diapositiva con 250 microlitri di un'appropriata soluzione anticorpale secondaria per un'incubazione di un'ora in una camera umidificata a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, lavare gli scivoli tre volte in PBST fresco come dimostrato e aggiungere 250 microlitri di perossidasi di rafano streptavidina appena preparata ad ogni diapositiva. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, lavare gli scivoli tre volte in PBST fresco. Quindi scrollarsi di tagliare l'eccesso di PBST e coprire ogni diapositiva con 250 microlitri di soluzione di fluoroforo-tiramide appena preparata.
Un minuto dopo, immergere le diapositive in PBST fresco seguito da tre lavaggi di due minuti in PBST fresco. Dopo l'ultimo lavaggio, applicare alcune gocce di una soluzione da glicerolo a PBS uno a uno sulle sezioni e verificare la presenza di un segnale di fluorescenza mediante microscopia a fluorescenza. Per rimuovere il primo complesso anticorpale, posizionare l'anticorpo etichettato scivola in 275 millilitri di soluzione di citrato di sodio bollente per almeno otto minuti come dimostrato.
Al termine del trattamento, aprire il coperchio e lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente prima di lavare gli scivoli tre volte con PBST per cinque minuti per lavaggio. Per macchiare per la seconda proteina bersaglio di interesse, dopo aver bloccato per il legame non specifico come dimostrato, etichettare ogni campione con 250 microlitri del secondo anticorpo primario di interesse a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, lavare gli scivoli tre volte per cinque minuti in PBST fresco per lavaggio prima di coprire ogni diapositiva con 250 microlitri di un'appropriata soluzione anticorpale secondaria per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, lavare gli scivoli tre volte in PBST fresco come dimostrato e aggiungere 250 microlitri di perossidasi di rafano streptavidina appena preparata ad ogni diapositiva. Per sviluppare il segnale per la seconda proteina bersaglio di interesse, dopo tre lavaggi PBST, trattare le diapositive con il tiramide coniugato al fluoroforo in un diverso spettro di fluorescenza. Per fermare lo sviluppo del segnale di tiroide, immergere le diapositive in PBST.
Quindi macchiare i campioni con un colorante nucleare appropriato. Per l'imaging mediante microscopia a fluorescenza, montare ogni scivolo etichettato colorante nucleare con una goccia di un mezzo di montaggio appropriato in un coverslip. Utilizzare l'obiettivo 4X per localizzare il tessuto sullo scivolo.
Passare all'obiettivo 10X per l'imaging e regolare il tempo di esposizione a 100-400 millisecondi con la sorgente luminosa tra il 40 e l'80% di intensità. Quindi ottenere immagini in ogni canale senza spostare il palco. Le immagini di ogni canale possono essere unite per formare un'immagine fluorescente multiplex.
Senza stripping tra la colorazione del primo e dell'anticorpo secondario, la seconda colorazione per l'idrossilasi tirosina raccoglierà segnali dalla prima proteina bersaglio di interesse con conseguente colorazione di tirosina idrossilasi falsa positiva, ad esempio in questo campione all'interno della corteccia surrenale. Per rimuovere la reattività incrociata dell'anticorpo nella perossidasi del rafano dalla prima immunostaining, è possibile eseguire lo stripping mediato a microonde di un minuto e otto minuti con conseguente doppio risultato di colorazione pulita. Nessun segnale significativo viene captato in campioni di controllo negativi.
Lo stripping di otto minuti nel tampone di citrato bollente è anche sufficiente per eliminare la reattività incrociata degli anticorpi per molti anticorpi comunemente usati nella ghiandola surrenale. In alcuni casi, tuttavia, un debole segnale falso positivo è ancora rilevabile e un aumento di 20 minuti al trattamento a microonde potrebbe ancora non rimuovere completamente la reattività incrociata dell'anticorpo. Durante l'imaging a fluorescenza, è importante non spostare lo stadio quando si cambia canale.
Tuttavia, potrebbe essere necessario riadattare lo stato attivo per ottenere immagini chiare di ciascun canale. Per ogni canale, assicurarsi di regolare il tempo di esposizione per assicurarsi che i segnali siano esposti in modo appropriato senza pixel o aree sovraesposti nelle immagini. Durante la procedura di colorazione, è importante mantenere i vetrini idratati dalla de-ceretta e le diapositive possono essere spogliate più volte con gli stessi metodi di stripping per consentire la colorazione multiplex.
