التجميع الفعال للهياكل فوق الجزيئية لتصميم الخلايا الدنيا وتسليم الأدوية لا يزال يشكل تحديا. هنا، نبرهن على بروتوكولات فعالة تنتج هياكل فوق احشائيّة تعتمد على بروتينات تشبه الإيلاستين. بروتوكولات التجميع المعروضة تولد هياكل فوق احشائية متعددة مع خصائص الفيزياء الكيميائية القابلة للتكيف، مثل الحويصلات والألياف والكوسيرفات.
تظهر المقصورات القائمة على غشاء البروتين سلوك فصل المرحلة وتسمح بتغليف جزيئات البضائع الفلورية المتنوعة كيميائيًا. للتعبير عن F20E20-mEGFP و F20E20-mCherry، تلقيح ثقافة التعبير الرئيسي من بين عشية وضحاها ما قبل الثقافة إلى OD600 من 0.3. احتضانه في 400 ملليلتر من متوسطة LB العقيمة تكملها المضادات الحيوية المناسبة في 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
عندما تصل ثقافة التعبير إلى OD600 من 0.5 إلى 0.8، أضف IPTG إلى تركيز نهائي من ميليمولار واحد، وخفض درجة حرارة الحضانة إلى 20 درجة مئوية. للتعبير عن ELP amphiphilic مع الأحماض الأمينية غير طبيعي، تلقيح ثقافة التعبير الرئيسي من بين عشية وضحاها E.coli قبل الثقافة التي تحتوي على البلازميدات المناسبة إلى OD من 0.3. احتضانه في 400 ملليلتر من متوسطة LB العقيمة تكملها كاناميسين وكلورامفينيكول في 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
لتحضير مخزون الأحماض الأمينية غير الطبيعي 100 مللي ميللي، أضف 206.2 ملليغرام من الأحماض الأمينية غير الطبيعية إلى ثمانية ملليلترات من الماء فائق البور. رفع درجة الH من الحل مع هيدروكسيد الصوديوم ثلاثة المولر، ومزيج بقوة. عندما يتم حل الأحماض الأمينية غير الطبيعية، وخفض درجة الحموضة إلى ما يقرب من 10.5، وإضافة الماء فائقة السخاء إلى حجم 10 ملليلتر.
تصفية الحل مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر معقمة، و aliquot ذلك في أنابيب التفاعل مليلتر اثنين. عندما تصل ثقافة التعبير إلى OD600 من 0.5 إلى 0.8، أضف الأحماض الأمينية غير الطبيعية إلى تركيز نهائي من ميليمولار اثنين. احتضانه لمدة 10 دقائق أخرى.
ثم حث التعبير عن البروتين الهدف وsRNA synthetase اللازمة عن طريق إضافة في وقت واحد من IPTG وعربينوز. خفض درجة حرارة الحضانة إلى 20 درجة مئوية، والسماح للتعبير عن الاستمرار لمدة 20 ساعة تقريبا. بعد الحضانة، حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أربع درجات مئوية و 4، 000 مرات ز لمدة 40 دقيقة.
Resuspend بيليه الخلية في عازلة التحلل مع lysozyme وPMSF. احتضان الحل لمدة 30 دقيقة على الجليد. ثم تجميد وذوبانه مرتين عن طريق غمر في النيتروجين السائل.
سونيكات التعليق، ومسح lysate بواسطة الطرد المركزي في 10، 000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 40 دقيقة. ثم تنقية البروتين باستخدام اللوني تقارب. بعد التهيّن البروتيني، قم بتخزينه عند أربع درجات مئوية حتى يتم استخدامه أكثر.
إضافة ميكرولتر واحد من صبغة الفلورسنت إلى 500 ميكرولترات من حل ELP، واحتضان رد فعل لحوالي 10 ساعات في 15 درجة مئوية في حين تهتز في ThermoMixer، مع التأكد من لحمايته من الضوء. لإزالة صبغة الفلورسنت المفرطة، قم بتكبيل غشاء غسيل الكلى في الماء فائق الخطورة لمدة 10 دقائق. قطع الغشاء إلى الحجم الصحيح ليتم وضعها على رأس فتح أنبوب رد الفعل مع الحل ELP النقر.
ثم إصلاح الغشاء إلى الفتح عن طريق إغلاق الأنبوب مع غطاء لا يحتوي على جوهر. املأ المسافة بين الغطاء والغشاء بالمخزن لمنع محاصرة الهواء. ثم ضع أنبوب التفاعل في المخزن المؤقت المختار ، ادفعه تحت السطح ، وقم بتحويله رأسًا على عقب.
إجراء غسيل الكلى لمدة ثلاث ساعات على الأقل في أربع درجات مئوية، مما يسمح لغسيل الكلى بالاستمرار لمدة ثلاث ساعات أخرى على الأقل بعد كل تغيير عازل. بالنسبة لتورم THF ، اطلب محلول ELP المتجانس ضد الفوسفات أو المخزن المؤقت تريس مع 7.5 pH ثابت. إعداد lyophilizer، وتبريده إلى درجة حرارة البدء لتجميد التجفيف.
Aliquot حل البروتين dialyzed في أنابيب التفاعل 1.5 ملليلتر، وختم مع قبعات مع ثقب صغير لتجنب فقدان العينة الصلبة بسبب التغيرات في الضغط في سياق تجميد التجفيف. تجمد العينات في النيتروجين السائل. أخذ عينات البروتين المجمدة من النيتروجين السائل، ووضعها على الفور في مزيل الجفاف لبدء تجميد التجفيف.
بعد العينة جافة تماما، تهوية مع النيتروجين الجاف، وعلى الفور إغلاق أغطية أنبوب التفاعل لتجنب ملامسة رطوبة الهواء. إضافة نقية THF لعينات lyophilized، ووضع الحل في 2000 2000 100 100 100 1000 1000 100000000000000000000000000000000000000000000000000000 سخني دراجات الحرارة إلى 30 إلى 60 درجة مئوية لتشكيل الفُيَس أو ما يصل إلى 90 درجة مئوية لتشكيل الألياف، ثم أعد أنابيب رد فعل جديدة إما بماء فائق السخاء أو عازلة.
بعد سونيكيشن، ضع حل ELP/THF والمياه المعدة أو العازلة في ثيرموستر لمدة خمس دقائق. ثم تقسيم حل ELP على أعلى الماء أو العازلة، والتأكد من أن فصل المرحلتين و interphase متميزة مرئية، ووضع الخليط مرة أخرى في الترموستر. اسمحوا العينة تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، والمضي قدما مع غسيل الكلى ضد الماء أو العازلة أو مع المجهر الفلوريسنس.
إعداد واحد إلى 50 ميكرومولار ELP الحل، وإضافة 10 إلى 20٪ 1-بوتانول. على الفور مزيج الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. وينبغي زيادة تعكر الحل أثناء الاختلاط، مما يدل على تشكيل الفينة.
لتحقيق توزيع حجم ضيق، بثق المحاصل مع الطارد مصغرة من خلال غشاء مع حجم المسام من ميكرومتر واحد. لتغليف الصبغة، مزيج ما يقرب من 40 ميكرولترات من حل ELP في 10 ملليمولار تريس-HCl مع ميكرولتر واحد من ديكستران تكساس ريد الأسهم الحل في DMSO. إضافة 10 ميكرولترات من 1-بوتانول، وبثق خمس إلى 10 مرات من خلال حقنة مجهزة بإبرة 0.25 في 25 ملليمتر.
وتتألف طريقة تورم THF من ثلاث خطوات متتالية والنتائج في تجميعات مختلفة فوق الجزيئات من ELP اعتمادا على درجة الحرارة. تظهر صور المجهر epifluorescence الفُيْسَرة العُيْدَسَة التي تم تجميعها من BDP-R20F20 وهياكل الرجفان التي تم تجميعها من BDP-R40F20. طريقة 1-بوتانول البثق يؤدي حصرا إلى تشكيل حويصلات ELP.
يتم إنتاج حوالي اثنين من أوامر حجم أكثر من vesicles مقارنة مع طريقة تورم THF. تم خلط BDP-R40F20 مع 10 إلى 15٪ البوتانول، وتم إعداد الفهيلات عن طريق بثق الخليط. تم تجميع هياكل مختلفة فوق الجزيئات من BDP-R40F20 عبر بروتوكول تورم THF.
تم تعديل درجة الـ PH للمخزن المؤقت ودرجة حرارة عملية التجميع لتشكيل إما coacervates أو fibrils أو الحويصلات. أخطاء صغيرة في بروتوكول التجميع يمكن أن يؤدي إلى تشكيل المجاميع. تم تغليف صبغة مشحونة بشكل إيجابي ATTO Rho 13 والديكستران الأحمر 3000 السكاريد في تجويف الحويصلات التي تم تجميعها من F20R20-mEGFP عبر طريقة بثق 1-بوتانول.
صور المجهر كونوكال تظهر الفينة في القناة الخضراء، والبضائع في القناة الحمراء، والتغليف الناجح في القناة المدمجة الناتجة. كما تم إثبات فصل المرحلة وسلوك الاندماج من أمفيفيليات ELP عند خلط كتل بناء PMBC واحدة مقابل مجموعات السكان PMBC المجمعة. يؤدي الخلط قبل تجميع PMBC إلى جزيئات موزعة بشكل متجانس داخل غشاء PMBC المجمع ، في حين يؤدي خلط مجموعات الحسوس المجمعة إلى بقع غشاء من الفلورس الأحمر أو الأخضر التي تكون مرئية لمدة 20 دقيقة على الأقل.
عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تولي اهتماما لأمر الخطوة الصحيحة وللفروق بين طريقة THF تورم وطريقة البثق بوتانول. بعد هذا البروتوكول، يمكن استخدام vesicles ELP كمكوكات تسليم المخدرات، كمنصة لردود الفعل الأنزيمية، مثل النسخ في المختبر والترجمة، أو في تشكيل خلايا الحد الأدنى الاصطناعية.
