Эффективная сборка надмолекулярных структур для минимальной конструкции клеток и доставки лекарств остается сложной задачей. Здесь мы демонстрируем эффективные протоколы, которые дают надмолекулярные структуры на основе амфифилических эластин-как белки. Представленные протоколы сборки генерируют универсальные надмолекулярные структуры с адаптируемыми физико-химическими свойствами, такими как пузырьки, волокна и коацерваты.
Белковые мембранные отсеки демонстрируют поведение фазового разделения и позволяют инкапсуляцию химически разнообразных флуоресцентных молекул груза. Для выражения F20E20-mEGFP и F20E20-mCherry, привить основные культуры выражения от ночной предварительной культуры до OD600 0,3. Инкубировать его в 400 миллилитров стерильных LB среды дополняется соответствующими антибиотиками при 37 градусов по Цельсию и 200 об / мин.
Когда культура выражения достигает OD600 от 0,5 до 0,8, добавьте IPTG к окончательной концентрации одного миллимолара и уменьшите температуру инкубации до 20 градусов по Цельсию. Для выражения амфифилической ELP с неестественной аминокислотой, привить основную культуру выражения от ночной E.coli пре-культуры, содержащей соответствующие плазмиды к OD 0,3. Инкубировать его в 400 миллилитров стерильных LB среды дополняется канамицин и хлорамфеникол при 37 градусов по Цельсию и 200 об / мин.
Для приготовления 100-миллимолярной неестественной аминокислоты добавьте 206,2 миллиграмма неестественной аминокислоты в восемь миллилитров ультрапурной воды. Поднимите рН раствора с трехмолярным гидроксидом натрия и тщательно перемешайте. Когда неестественная аминокислота растворяется, опустите рН примерно до 10,5 и добавьте ультрапурную воду в объем 10 миллилитров.
Фильтровать раствор стерильным 0,22-микрометровым фильтром и алицитировать его в двухми миллилитровых реакционные трубки. Когда культура выражения достигает OD600 от 0,5 до 0,8, добавьте неестественную аминокислоту в окончательную концентрацию в два миллимолара. Инкубировать его еще 10 минут.
Затем индуцировать экспрессию целевого белка и необходимой синтетазы тРНК через одновременное добавление IPTG и арабинозы. Уменьшите температуру инкубации до 20 градусов по Цельсию и позвольте выражению продолжаться в течение примерно 20 часов. После инкубации, урожай клеток центрифугации при четырех градусах цельсия и 4000 раз г в течение 40 минут.
Повторное производство клеточных гранул в буфере лиза с лизозимом и ПМСФ. Инкубировать раствор в течение 30 минут на льду. Затем заморозить и разморозить его дважды, погружаясь в жидкий азот.
Sonicate подвески, и очистить лисат центрифугации в 10000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 40 минут. Затем очистите белок с помощью хроматографии сродства. После элюции белка, хранить его при четырех градусах по Цельсию до дальнейшего использования.
Добавьте один микролитр флуоресцентного красителя в 500 микролитров раствора ELP и инкубировать реакцию в течение примерно 10 часов при 15 градусах по Цельсию во время встряхивания в ThermoMixer, убедившись, что защитить ее от света. Чтобы удалить чрезмерное флуоресцентного красителя, эквилибрировать диализ мембраны в ультрапурной воде в течение 10 минут. Разрежьте мембрану на правильный размер, чтобы поместить ее поверх отверстия реакционной трубки с помощью нажатого раствора ELP.
Затем зафиксните мембрану до открытия, закрыв трубку крышкой, которая не имеет ядра. Заполните пространство между крышкой и мембраной буфером, чтобы предотвратить захват воздуха. Затем поместите реакционной трубки в выбранном буфере, нажмите его ниже поверхности, и перевернуть его вверх дном.
Выполните диализ в течение по крайней мере трех часов при четырех градусах Цельсия, что позволяет диализу продолжаться еще как минимум три часа после каждого изменения буфера. При отеке THF обализуете однородный раствор ELP против фосфатного или трис-буфера со стабильным рН 7.5. Приготовьте лиофилизатор и охладьте его до стартовой температуры для замораживания сушки.
Aliquot диализированного белкового раствора в 1,5-миллилитровых реакционной трубки, и печать с крышками с небольшим отверстием, чтобы избежать потери твердого образца из-за изменения давления в ходе замораживания сушки. Шок-заморозить образцы жидкого азота. Возьмите замороженные образцы белка из жидкого азота, и сразу же поместите их в лиофилизатор, чтобы начать лиофилизатор.
После того, как образец полностью высохнет, проветрить его сухим азотом и немедленно закрыть крышки реакционной трубки, чтобы избежать контакта с влагой воздуха. Добавьте чистый THF в лиофилизированные образцы и поместите раствор в звуковую ванну с ледяной водой на 15 минут. Разогреть термоциклер до 30 до 60 градусов по Цельсию для образования пузырьков или до 90 градусов по Цельсию для образования волокна, и подготовить новые реакционные трубки с ультрапурной водой или буфером.
После соникации поместите раствор ELP/THF и подготовленную воду или буфер в термоциклер в течение пяти минут. Затем расслоение ELP решение на верхней части воды или буфера, убедившись, что разделение двух фаз и различных межфазы видна, и поместите смесь обратно в термоциклер. Пусть образец остынет при комнатной температуре в течение 10 минут, и приступить к диализу против воды или буфера или с флуоресцентной микроскопии.
Приготовьте от одного до 50-микромолярского раствора ELP и добавьте от 10 до 20%1-бутанола. Немедленно смешайте раствор, трубя вверх и вниз. Мутность раствора должна увеличиваться при смешивании, что указывает на образование пузырьков.
Для достижения узкого распределения размера, экструдировать пузырьки с мини экструдер через мембрану с поры размером один микрометр. Для инкапсуляции красителя смешайте около 40 микролитров раствора ELP в 10-миллимолярной Tris-HCl с одним микролитером раствора Dextran Texas Red в DMSO. Добавьте 10 микролитров 1-бутанола и выдавлите 5-10 раз через шприц, оснащенный иглой 0,25 на 25 миллиметров.
Метод отеков THF состоит из трех последовательных шагов и приводит к различным надмолекулярным агрегатам ELP в зависимости от температуры. На снимках микроскопии эпифлюоресценции показаны пузырьки, собранные из BDP-R20F20 и фибриллярдных структур, собранных из BDP-R40F20. Метод экструзии 1-бутанола приводит исключительно к образованию elP vesicles.
Около двух порядков величины больше пузырьков производятся по сравнению с методом THF отек. BDP-R40F20 смешивали с 10 до 15% бутанола, а пузырьки готовили через экструзию смеси. Различные надмолекулярные структуры были собраны из BDP-R40F20 с помощью протокола отеков THF.
РН буфера и температура процесса сборки были скорректированы, чтобы сформировать либо коасерваты, фибриллы, или пузырьки. Небольшие ошибки в протоколе сборки могут привести к формированию агрегатов. Положительно заряженный краситель ATTO Rho 13 и полисахарид декстран красный 3000 были инкапсулированы в люмен пузырьков, собранных из F20R20-mEGFP с помощью метода экструзии 1-бутанола.
На снимках конфокальные микроскопии показаны пузырьки в зеленом канале, груз в красном канале и успешная инкапсуляция в полученном объединенном канале. Было также продемонстрировано фазовое разделение и слияние амфифилов ELP при смешивании отдельных строительных блоков PMBC по сравнению с собранными популяциями PMBC. Смешивание до сборки PMBC приводит к однородно распределенных молекул в собранной мембране PMBC, в то время как смешивание собранных популяций пузырьков приводит к мембранным пятнам красной или зеленой флуоресценции, которые видны в течение по крайней мере 20 минут.
При попытке этой процедуры, важно обратить внимание на правильный порядок шага и различия между методом THF отек и метод экструзии бутанола. Следуя этому протоколу, ELP vesicles могут быть использованы в качестве шаттлов доставки наркотиков, в качестве платформы для энзиматических реакций, таких как в пробирке транскрипции и перевода, или в формировании синтетических минимальных клеток.
