أسلوبنا الأنزيمي استخدام oligomer البروتين مع عدد تسيطر عليها من درجة البلمرة. وهو إعداد عينة مثالية لدراسة الطيفية للقوة أحادية الجزيء وكذلك بناء المواد القائمة على البروتين. طريقتنا لا يقدم السيستين إلى البروتين المستهدف.
لأن السيستين هو واحد من أهم المخلفات الوظيفية للبروتين، فإنه يسهل بناء البروتين مادة بلمرة أو الإنزيمات. يدل الإجراء سيكون ييبين دينغ وShengchao شي، طلاب غراد من مختبري. للبدء، قم بحل 20 غراما من كرومات البوتاسيوم في 40 ملليلتر من الماء فائق البور في منقار.
إضافة ببطء 360 ملليلتر من حمض الكبريتيك المركزة إلى محلول dichromate البوتاسيوم واستخدام قضيب زجاجي لتحريك بلطف. ضع غطاء زجاجي في حمض الكرومك ونقله إلى فرن عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تنظيف الغطاء بالماء ثم الكحول الإيثيل المطلق وتجفيف الغطاء مع تيار من النيتروجين.
غمر تماما في coverlip 1٪ حجم من قبل حجم مفتاح APTES toluene لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع حمايتهم من الضوء. غسل الغطاء مع التولوين أولا ثم مع الكحول الإيثيل المطلقة وتجفيف الأغطية مع تيار من النيتروجين. احتضان الغطاء في 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ثم ندعه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
استخدام ماصة لإضافة 200 ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر Sulfo-SMCC في حل DMSO بين اثنين من الأغطية غير المُشلَّولة واحتضان لمدة ساعة واحدة محمية من الضوء. بعد ساعة، غسل الأغطية مع DMSO أولا ثم مع الكحول الإيثيل المطلق لإزالة المتبقية Sulfo-SMCC. جفف غطاء الغط تحت تيار من النيتروجين.
مازيت 60 ميكرولترات من 200 ميكرومولار GL-ELP-50 محلول cys-البروتين على غطاء وظيفية واحتضان في 25 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات تقريبا. بعد ذلك، قم بغسل الغطاء بالماء فائق الخطورة لإزالة الـ GL-ELP-50-cys غير المنقحة. لإعداد سطح cantilever وظيفية، أولا غمر cantilevers في حمض الكروم وتنظيف cantilevers في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
استخدام الماء والكحول الإيثيلي المطلقة لغسل حمض. غمر cantilever مع 1٪ حجم من قبل حجم مفتاح APTES toluene لأداء الملوحة الأمينية في غطاء أنبوب من البلاستيك لمدة ساعة واحدة. شطف cantilever مع الكحول الإيثيل المطلقة ثم خبز cantilever في 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
غمر cantilever في حل Sulfo-SMCC لمدة ساعة واحدة ثم شطف cantilever مع الكحول الإيثيلي المطلق. لربط cys-ELP-50-NGL إلى السطح، غمر الـ cantilevers في cys-ELP-50-NGL مع مجموعة maleimide من Sulfo-SMCC لمدة 1.5 ساعة. ثم غسل بعيدا غير المنقحة cys-ELP-50-NGL على cantilever عن طريق المياه فائقة البور.
المقبل, تزج cantilever وظيفية في محلول يحتوي على 200 ميكرولترات من 50 ميكرومولار GL-CBM-XDockerin حل البروتين مع 200 نانومولار OaAEP1 ووضعها في 25 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. ثم استخدام AFM العازلة لغسل البروتين غير المنقح. من الأهمية بمكان أن تغسل البروتين المتبقي غير المنقح قبل تجربة AFM لأنها ستشكل أزواجًا من التماسك دوكرين وكتلة الـ cantilever لأخذ بروتين جديد على السطح.
لربط وحدة الربط التماسك T-L-البروتين من الفائدة-NGL إلى GL-ELP-50 شل على سطح الغطاء، إضافة 15 ميكرولترات من OaAEP1 على غطاء والسماح لها احتضان لمدة 30 دقيقة. استخدام 15 إلى 20 ملليلتر من AFM العازلة لغسل أي البروتينات غير المنقحة. أضف 100 ميكرولتر من بروتين TEV لشق وحدة البروتين في موقع التعرف على TEV لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية.
ثم استخدام 15 إلى 20 ملليلتر من AFM العازلة لغسل البروتينات المتبقية. ربط وحدة الربط التماسك-T-L-البروتين من الفائدة-NGL إلى الزجاج GL-ubiquitin-NGL بواسطة OaAEP1 لمدة 30 دقيقة. اعتمادا على البروتين يبني GL-ubiquitin-NGL التي سيتم بناؤها على سطح الزجاج, كرر خطوات إعداد البوليبروتين n1 مرات.
حذف رد فعل شق TEV الماضي إلى التماسك الاحتياطي على البوليمر البروتين كما التماسك-TEV-L-ubiquitin-n-NGL الزجاج. إضافة ملليلتر واحد من AFM العازلة مع كلوريد الكالسيوم 10 ملليمولار وخمسة حمض الأسكوربيك ملليمولار إلى غرفة السوائل AFM. اختر طرف D من مسبار AFM الوظيفي للتجربة.
غمر المسبار في المخزن المؤقت لـ AFM. سحب cantilever في سرعة ثابتة من 400 نانومتر في الثانية من السطح. في هذه الأثناء، تسجيل منحنى تمديد القوة بمعدل عينة من 4،000 هرتز.
استخدام نظرية equipartition لمعايرة cantilever في AFM العازلة مع دقيقة قيمة ثابتة الربيع K قبل كل تجربة. نعلق تلميح cantilever وظيفية مع دوكرين إلى السطح البروتين المودع وظيفية مع التماسك لتشكيل زوج التماسك دوكرين. ثم فتح برنامج معالجة البيانات JPK وتحديد منحنى تمديد القوة مع نمط مثل sawtooth مميزة وقوة مفرزة عالية.
في هذه الدراسة، لم تؤثر بقايا NGL التي أدخلت بين البروتينات المجاورة من قبل ربط OaAEP1 على استقرار مونومر البروتين في البوليمر الذي تم التعبير عنه حيث كانت القوة المتكشفة وزيادة طول الكونترا قابلة للمقارنة مع الدراسة السابقة. قدمت تنقية rubredoxin شكل الحديديك نموذجي قمم امتصاص الأشعة فوق البنفسجية تصور في 495 نانومتر و 575 نانومتر في حين أن شكل الزنك لم. SDS صفحة هلام النتائج من الهضم خطوة وربط تظهر متماسكة TEV-L-ubiquitin, خليط البروتين نتيجة من شق TEV, نقية GFP-TEV-protease, والمنتج النقي GL-ubiquitin.
يتم عرض خليط الربط GL-ubiquitin المشقوق والتماسك-TEV-L-ubiquitin liga مع أو بدون OaAEP1 و OaAEP1 النقي كذلك. من المهم أن تعمل على وظيفية السطح مع النشط Sulfo-SMCC لمرفق الببتيد بنجاح. هنا نقدم طريقة جديدة لبناء البروتين البلمرة.
يسهل على الباحثين دراسة نظام البروتين المعقد باستخدام التحليل الطيفي للقوة أحادية الجزيء. حمض الكروميك هو تآكل بقوة والحمضية. كن حذرا عند إعداد والتعامل معها.
