يسمح تحليل الربط القربي للمستخدمين باكتشاف التفاعلات البروتينية والبروتينية في الموقع ، مما يكشف عن الأنماط المكانية والزمانية للتفاعلات. هذه التقنية يمكن أن تساعد في الإجابة على أسئلة هامة حول تنظيم تطوير C.elegans. هذه التقنية توفر حساسية مماثلة للكشف عن التفاعلات البروتينية البروتينية دون تعقيد تقنيات أخرى، مثل فريت وBiFC.
الأفراد الذين لم تشريح الديدان لاطلاق سراح السناد قد النضال مع هذه الخطوة. ممارسة تشريح الديدان، واستخدامها لflufluorescence لإتقان تقنيات المعالجة وتشريح قبل الانتقال إلى جيش التحرير الشعبي. للبدء، اختر 30 إلى 40 ديدان البالغين الشباب في طبق زجاجي ساعة تحتوي على 500 ميكرولترات من 1x M9 وlevamisole.
بعد جمع الديدان، وإزالة بعناية وتجاهل معظم وسائل الإعلام لإزالة البكتيريا التي يتم نقلها جنبا إلى جنب مع الديدان. إضافة في 500 ميكرولترات جديدة من 1x M9 وlevamisole، واستخدام ماصة لرسم بلطف والاستغناء عن وسائل الإعلام لشطف الديدان. قم بإزالة معظم الوسائط وتجاهلها بعناية.
كرر غسل مرتين إلى ثلاث مرات. بعد يغسل، وترك الديدان في حوالي 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام لمدة لا تزيد عن ثماني دقائق. باستخدام ماصة من الزجاج أو البولي إيثيلين، نقل الديدان إلى شريحة مجهر 25 ملليمترا في 75 ملليمتر المغلفة مع 001٪ بولي-L-ليسين.
إزالة الوسائط الزائدة بحيث يبقى ما يقرب من 15 ميكرولترات من الوسائط على الشريحة. إزالة العازلة الزائدة أمر بالغ الأهمية لضمان أن الديدان تشريح والسناد سوف تلتزم الشريحة. تحت مجهر تشريح، مع اثنين من 26 1/2-قياس الإبر، ووضع إبرة واحدة على الآخر بحيث ينتهي شكل زوج من مقص.
باستخدام الإبر الموجهة في هذا الشكل، وقطع الديدان وراء البلعوم لإطلاق الجراثيم. تشريح كل الديدان في غضون خمس دقائق. بعد أن يتم تشريح جميع الديدان، ضع بلطف غطاء 22 ملليمترًا في 40 ملليمترًا فوق الشريحة بحيث يكون عموديًا على الشريحة.
يجب أن تتعطل نهايات الغطاء من الشريحة. تجميد الشرائح على كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا الحفاظ على الجليد الجاف لمدة 20 دقيقة على الأقل. ضع قلم رصاص مبرد بلطف فوق الغطاء لمنع الغطاء من أن يصبح فضفاضًا بسبب توسع الجليد.
عندما تكون جاهزة للتهيّم، افض الغبار قبالة الأغطية مع قلم رصاص، وتراجع على الفور الشريحة في جرة تحتوي على الطازجة، والميثانول الجليد الباردة لمدة دقيقة واحدة. ثم مسح بلطف حواف الشريحة المحيطة العينة، وتطبيق 150 ميكرولترات من الفورمالديهايد تثبيت في درجة حرارة الغرفة لإصلاح لمدة خمس دقائق. المس الشريحة إلى منشفة ورقية بزاوية عمودية 90 درجة للسماح للتركيل بالركض من الشريحة وامتصاصها في منشفة ورقية.
كتلة الشرائح مرتين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في جرة كوبلين مع 50 ملليلتر من PBT / BSA. ثم منع الشرائح مع حل PBT / BSA التي تحتوي على مصل الماعز العادي 10٪. قم بمسح الحواف التي تحيط بالشريحة بلطف، ثم قم بتطبيق 100 ميكرولترات من الحل على كل شريحة.
وتهيج بلطف الشريحة للمساعدة في نشر الحل. احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح للحل بالهرب من الشريحة، ومسح الحواف برفق.
لمنع الشرائح، قم بتطبيق قطرة واحدة من كاشف الحجب على المساحة 14-millimeter-14--millimeter. احتضان الشرائح لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة. ضع الشرائح على منشفة ورقية للسماح للحجب تشغيل كاشف قبالة الشريحة، ومسح حواف بلطف.
استخدم جسم الجسم المضاد لتخفيف الأجسام المضادة الأولية. تطبيق 40 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأولية المخففة لكل مساحة 14-14 ميليمتر على الشرائح. ضع الشرائح في غرفة رطبة، وحضنها بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.
في الصباح، وغسل الشرائح مرتين لمدة خمس دقائق، مع كل 50 ملليلتر من 1x غسل العازلة في درجة حرارة الغرفة في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على مجموعة شاكر المدارية إلى 60 دورة في الدقيقة. ضع الشرائح على منشفة ورقية للسماح للتخزين المؤقت بالهرب من الشريحة، ومسح الحواف برفق.
إعداد حل 40 ميكرولتر تحتوي على تحقيقات زائد وناقص. أضف الحل إلى كل مساحة 14-14 مليمتر. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.
غسل الشرائح مرتين لمدة خمس دقائق لكل من مع 50 ملليلتر من 1x غسل العازلة A في درجة حرارة الغرفة في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على مجموعة شاكر المدارية إلى 60 دورة في الدقيقة. تمييع العازلة ربط واحد إلى خمسة مع المياه فائقة الخطورة.
استخدم هذا المخزن المؤقت لتمييع الرباط من 40 إلى 40 لإعداد مخزون عامل من حل الربط. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح للمخزن المؤقت للغسيل بالهرب من الجانبين، ومسح الحواف برفق. أضف 40 ميكروليتر من محلول الربط لكل مساحة 14 في 14 ملليمتر.
احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد غسل وتجفيف الشرائح كما سبق وصفها، إضافة 40 ميكرولترات من حل تضخيم الطازجة، محمية من الضوء، إلى كل مساحة 14-by-14 ملليمتر. احتضان الشرائح في غرفة رطبة، مظلمة لمدة ساعة واحدة و 40 دقيقة في 37 درجة مئوية.
غسل الشرائح مرتين لمدة 10 دقائق لكل من 50 ملليلتر من 1x غسل العازلة B، وغسل الشرائح مرة واحدة لمدة دقيقة واحدة مع 50 ملليلتر من 01x غسل العازلة B.After تجفيف محيط المغلفة الايبوكسي من الشريحة، إضافة 10 ميكرولترات من متوسطة التركيب لكل عينة، ووضع بلطف غطاء على رأس، مما يسمح للواسطة تصاعد للانتشار. الطلاء حول حافة غطاء مع طلاء الأظافر لختم الغطاء والشريحة. تجنب تحريك غطاء الأغطية.
دع طلاء الأظافر يصلب لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة، ومحمية من الضوء. كشف الالضمان المشترك للمناعة من الجراثيم مع الأجسام المضادة العلم وGFP نمطها التعبير في الخط الجرثومي. في حين تم التعبير عن GFP في جميع أنحاء الخط الجرثومي، كان التعبير OMA-1:GFP يقتصر على الباسيتين المتأخر والبويضات.
يظهر الالمائي في FLAG أن 3xFLAG:DLC-1 تم التعبير عنه في جميع أنحاء الخط الجرثومي في كل من السلالات. المنطقة ذات الأهمية لـ PLA quantification في الخط الجرثومي شملت الباسيتين المتأخر من خلال البويضات في جميع الجراثيم. هذه هي منطقة التعبير OMA-1.
3xFLAG: DLC-1، OMA-1: GFP يبدو أن لديها كمية أكبر من بؤر جيش التحرير الشعبي داخل هذه المنطقة مقارنة مع 3xFLAG:DLC-1، GFP خطوط الجرثومية. تأكد من وجود ما يكفي من المياه لرفع الرطوبة في الغرفة. أيضا، تأكد من أن الشرائح هي مستوى داخل الغرفة لمنع الجريان السطحي من الكواشف.
بعد قياس التقارب، يمكن تصوير الغدد الصماء المقذوفة على مجهر confocal وتحديد كمي باستخدام فيجي، سير عمل ImageJ. ويمكن أن يساعد هذا القياس الكمي في تحديد ما إذا كان التفاعل ذا أهمية إحصائية. جيش التحرير الشعبى الصينى سمح لنا بتقييم التفاعلات في الموقع بين المنظمين الحرجة للتنمية الوراثية الخيطية.
