Yakınlık ligasyon tsalimi, kullanıcıların protein-protein etkileşimlerini yerinde algılamalarını sağlar ve etkileşimlerin mekansal ve zamansal desenlerini ortaya çıkarır. Bu teknik, C.elegans gelişiminin düzenlenmesi ile ilgili önemli soruların cevaplanabiliyor. Bu teknik, FRET ve BiFC gibi diğer tekniklerin karmaşıklığı olmadan protein-protein etkileşimlerinin saptanması için karşılaştırılabilir duyarlılık sunar.
Gonadları serbest bırakmak için solucanları hiç kesmemiş bireyler bu adımla mücadele edebilirler. Solucanları inceleme alıştırması yapın ve PLA'ya geçmeden önce kullanım ve diseksiyon tekniklerini mükemmelleştirmek için bunları immünororesans için kullanın. Başlamak için, 1x M9 ve levamisole 500 mikrolitre içeren bir saat cam çanak içine 30 ila 40 genç yetişkin solucanlar seçin.
Solucanlar topladıktan sonra, dikkatle kaldırmak ve solucanlar ile birlikte transfer bakterileri kaldırmak için ortamın çoğunu atın. 1x M9 ve levamisole taze 500 mikrolitre ekleyin ve yavaşça çizmek ve solucanlar durulamak için medya dağıtmak için pipet kullanın. Ortamın çoğunu dikkatlice çıkarın ve atın.
Yıkamayı 2-3 kez tekrarlayın. YıkTıktan sonra solucanları yaklaşık 100 mikrolitre lik bir ortamda sekiz dakikadan fazla bekletin. Bir cam veya polietilen pipet kullanarak, solucanları %001 poli-L-l-lizin ile kaplanmış 25 milimetrelik 75 milimetrelik mikroskop kaydıranına aktarın.
Slaytta yaklaşık 15 mikrolitre ortam kalması için fazla ortamı kaldırın. Aşırı arabelleğin kaldırılması, parçalanmış solucanların ve gonadların slayta yapışmasını sağlamak için çok önemlidir. Bir diseksiyon mikroskop altında, iki 26 1/2-gauge iğneler ile, uçları makas bir çift oluşturacak şekilde diğer üzerinde bir iğne yerleştirin.
Bu şekilde odaklı iğneler kullanarak, germlines serbest bırakmak için farinks arkasındaki solucanlar kesti. Beş dakika içinde tüm solucanları inceleyin. Tüm solucanlar kesildikten sonra, slamanın üzerine 22 milimetrelik 40 milimetrelik bir kapak kayması yerleştirin, böylece kaydırağa dik kalır.
Kapak kaymasının uçları slayttan sarkmalıdır. En az 20 dakika kuru buz üzerinde muhafaza önceden soğutulmuş alüminyum blok slaytlar dondurun. Buz genişlemesi nedeniyle kapağın gevşemesini önlemek için kapağın üzerine soğutulmuş bir kalemi yavaşça yerleştirin.
Fiksasyon için hazır olduğunuzda, bir kalem ile kapakları kapalı flick ve hemen bir dakika için taze, buz gibi metanol içeren bir kavanoza slayt daldırma. Daha sonra numuneyi çevreleyen slaytın kenarlarını hafifçe silin ve beş dakika boyunca düzeltmek için oda sıcaklığında 150 mikrolitre formaldehit fiksatif uygulayın. Fiksatif slayt kapalı çalıştırmak ve kağıt havlu içine absorbe izin dik 90 derecelik açıyla bir kağıt havlu slayt dokunun.
50 mililitre PBT/BSA içeren coplin kavanozunda oda sıcaklığında 15 dakika boyunca slaytları iki kez engelleyin. Daha sonra% 10 normal keçi serumu içeren bir PBT / BSA çözeltisi ile slaytlar blok. Slaydın çevreleyen kenarları yavaşça silin ve her slayta çözeltinin 100 mikrolitresini uygulayın.
Ve yavaşça çözüm yayılmasına yardımcı olmak için slayt ajite. Nemli bir odada oda sıcaklığında bir saat kuluçka. Çözümün slayttan akmasını sağlamak için slaydı kağıt havlunun üzerine yerleştirin ve kenarları nazikçe silin.
Slaytları engellemek için, 14 milimetreye 14 milimetrelik alana blokaj reaktifinin bir damlasını uygulayın. Kaydırakları nemli bir odada 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Engelleme reaktifinin slayttan akmasını sağlamak için slaytları kağıt havlunun üzerine yerleştirin ve kenarları nazikçe silin.
Birincil antikorları seyreltmek için antikor dilüent kullanın. Slaytlara seyreltilmiş primer antikor çözeltisinin 40 mikrolitresini 14 ila 14 milimetrelik alana uygulayın. Bir nemli odaya slaytlar yerleştirin ve dört santigrat derece gecede kuluçka.
Sabahları, slaytları beş dakika boyunca iki kez yıkayın, her biri Coplin kavanozundaki oda sıcaklığında 50 mililitre 1x yıkama tamponu A ile. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın. Kaydırma tamponunu kaydırağının akmasına izin vermek için slaytları kağıt havlunun üzerine yerleştirin ve kenarları nazikçe silin.
Artı ve eksi problar içeren 40 mikrolitrelik bir çözelti hazırlayın. Çözümü her 14'e 14 milimetrelik alana ekleyin. 37 santigrat derece bir saat boyunca nemli bir odada slaytlar kuluçka.
Kaydırakları her biri coplin kavanozunda oda sıcaklığında 50 mililitre 1x yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın. Ligasyon tamponunu 1-5'e kadar ultra saf su ile seyreltin.
Ligasyon çözeltisi çalışan bir stok hazırlamak için ligaz 1 ila 40 seyreltmek için bu tampon kullanın. Yıkama arabellesinin yanlardan akmasını sağlamak için slaydı kağıt havlunun üzerine yerleştirin ve kenarları nazikçe silin. Her 14 ila 14 milimetrelik alana 40 mikrolitre ligasyon çözeltisi ekleyin.
37 santigrat derece 30 dakika nemli bir odada slaytlar kuluçka. Slaytları daha önce açıklandığı gibi yıkayıp kuruttuktan sonra, her 14'e 14 milimetrelik alana ışıktan korunan 40 mikrolitre taze hazırlanmış amplifikasyon çözeltisi ekleyin. 37 santigrat derece bir saat ve 40 dakika boyunca nemli, karanlık oda slaytlar kuluçka.
Slaytları her biri 10 dakika boyunca 10'ar mililitre 1x yıkama tamponU B ile yıkayın ve slaytları bir dakika boyunca 50 mililitre 01x yıkama tamponU B.Slaytın epoksi kaplı çevresini kuruttuktan sonra, her numuneye 10 mikrolitre montaj ortamı ekleyin ve üzerine hafifçe bir kapak koyarak montaj ortamının yayılmasını bekleyin. Coverslip ve slayt mühür için oje ile coverslip kenarına boya. Kapak kaymasını hareket ettirmekten kaçının.
Ojenin ışıktan korunduğu oda sıcaklığında en az 20 dakika sertleşsin. Flag ve GFP antikorları ile germlines co-immunostaining germline ifade desen ortaya. GFP germline boyunca ifade edilirken, OMA-1:GFP ekspresyonu geç pakimeten ve oositlerle sınırlıydı.
BAYRAK immünboyama 3xFLAG:DLC-1 her iki suşlarda da germline boyunca ifade edildiğini göstermektedir. Germline PLA nicelleştirme için ilgi bölgesi tüm germlines yumurtayoluyla geç pachytene kapsamaktadır. Burası OMA-1 ifadesinin bulunduğu bölgedir.
3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP germlines 3xFLAG:DLC-1, GFP mikropları ile karşılaştırıldığında bu bölgede PLA foci daha büyük miktarda olduğu ortaya çıktı. Haznedeki nemi yükseltmek için yeterli su olduğundan emin olun. Ayrıca, reaktiflerin akmasını önlemek için slaytların oda nın içinde eşit olduğundan emin olun.
Yakınlık ligasyon testinin ardından, ekstrüde gondadlar konfokal mikroskop üzerinde görüntülenebilir ve Fiji, ImageJ iş akışı kullanılarak ölçülebilir. Bu niceleme etkileşimistatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için yardımcı olabilir. PLA bize nematod germline gelişimi kritik düzenleyiciler arasındaki yerinde etkileşimleri değerlendirmek için izin verdi.
