근접 결찰 분석법은 사용자가 장소에서 단백질 단백질 상호 작용을 감지할 수 있게 해 주며, 상호 작용의 공간 적 및 시간적 패턴을 드러냅니다. 이 기술은 C.elegans 개발의 규제에 대한 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 FRET 및 BiFC와 같은 다른 기술의 복잡성 없이 단백질-단백질 상호 작용의 검출을 위한 비교감도를 제공합니다.
곤드를 풀어 놓기 위해 벌레를 해부한 적이없는 개인은이 단계로 어려움을 겪을 수 있습니다. 벌레를 해부하는 연습을 하고, PLA로 이동하기 전에 처리 및 해부 기술을 완벽하게 하기 위해 면역 불경을 위해 사용합니다. 우선 30~40마리의 청년 벌레를 1x M9와 레바미솔 500마이크로리터가 들어 있는 시계 유리 접시에 넣으세요.
벌레를 수집 한 후, 조심스럽게 제거하고 벌레와 함께 전송되는 박테리아를 제거하기 위해 미디어의 대부분을 폐기. 1x M9과 레바미솔의 신선한 500 마이크로리터를 추가하고 파이펫을 사용하여 부드럽게 잡아서 미디어를 분배하여 벌레를 헹구십시오. 조심스럽게 제거하고 미디어의 대부분을 폐기.
2~3회 세척을 반복합니다. 세서히 후, 웜을 약 100마이크로리터의 미디어에 8분 이상 방치하십시오. 유리 또는 폴리에틸렌 파이펫을 사용하여 웜을 001% 폴리 L-리신으로 코팅한 25mm-75mm 현미경 슬라이드로 이송합니다.
약 15 마이크로리터의 미디어가 슬라이드에 남아 있도록 초과 미디어를 제거합니다. 여분의 버퍼를 제거하는 것은 해부된 웜과 생식선이 슬라이드를 준수하는지 확인하는 데 중요합니다. 26 1/2 게이지 바늘이있는 해부 현미경에서 한 바늘을 다른 바늘 위에 놓고 끝이 한 쌍의 가위를 형성합니다.
이런 식으로 지향 바늘을 사용하여, 배검을 해제하는 인두 뒤에 벌레를 잘라. 5분 이내에 모든 웜을 해부합니다. 모든 벌레가 해부된 후 슬라이드 에 수직이되도록 슬라이드 위에 22mm 에서 40mm 의 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다.
커버슬립의 끝은 슬라이드를 끊어야 합니다. 건조 얼음에 유지되는 미리 차가운 알루미늄 블록에 슬라이드를 20분 이상 동결하십시오. 차가운 연필을 커버슬립 위에 부드럽게 놓아 얼음 팽창으로 인해 커버슬립이 느슨해지는 것을 방지합니다.
고정을 준비하면 연필로 커버립을 튕기고 슬라이드를 1 분 동안 신선하고 차가운 메탄올이 들어있는 항아리에 즉시 담급다. 그런 다음 샘플을 둘러싼 슬라이드의 가장자리를 부드럽게 닦고 실온에서 고정 포름알데히드 150 마이크로 리터를 적용하여 5 분 동안 수정하십시오. 슬라이드를 90도 각도의 수직 으로 종이 타월에 터치하여 고정이 슬라이드에서 벗어나 종이 타월에 흡수되도록 합니다.
PBT/BSA의 50 밀리리터와 코플린 항아리에 실온에서 15 분 동안 슬라이드를 두 번 차단합니다. 그런 다음 10%의 일반 염소 세럼이 포함된 PBT/BSA 솔루션으로 슬라이드를 차단합니다. 슬라이드를 둘러싸는 가장자리를 부드럽게 닦고 각 슬라이드에 솔루션의 100 마이크로리터를 적용합니다.
그리고 부드럽게 솔루션을 확산하는 데 도움이 슬라이드를 동요. 습한 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 슬라이드를 종이 타월에 놓고 용액이 슬라이드에서 벗어날 수 있도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦습니다.
슬라이드를 차단하려면 블로킹 시약 1방울을 14mm-14mm 공간에 적용합니다. 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 1 시간 동안 슬라이드를 배양하십시오. 슬라이드를 종이 타월에 놓고 차단 시약이 슬라이드에서 실행되도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦습니다.
1 차적인 항체를 희석하기 위하여 항체 희석제를 이용합니다. 슬라이드에 14-14밀리미터 공간당 희석된 1차 항체 용액의 40마이크로리터를 적용합니다. 슬라이드를 습한 챔버에 놓고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양하십시오.
아침에는 5분 동안 슬라이드를 두 번 씻고, 각 슬라이드는 코플린 항아리의 실온에서 1x 세척 버퍼 A의 50 밀리리터로 세척합니다. 60 rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 코플린 항아리를 설정합니다. 슬라이드를 종이 타월에 놓고 세척 버퍼가 슬라이드에서 흘러 나와 가장자리를 부드럽게 닦아냅니다.
플러스 및 마이너스 프로브를 포함하는 40 마이크로리터 솔루션을 준비합니다. 각 14-14밀리미터 공간에 솔루션을 추가합니다. 섭씨 37도에서 한 시간 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 배양하십시오.
코플린 항아리의 실온에서 1x 세척 버퍼 A의 50 밀리리터로 5 분 동안 슬라이드를 두 번 씻으십시오. 60 rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 코플린 항아리를 설정합니다. 초순수물로 결찰 버퍼를 1~5개 희석시 희석시다.
이 버퍼를 사용하여 리갈아를 1에서 40으로 희석하여 리기션 솔루션의 작업 재고를 준비합니다. 슬라이드를 종이 타월에 놓고 세척 버퍼가 측면을 벗어나고 가장자리를 부드럽게 닦습니다. 각 14-14밀리미터 공간에 40마이크로리터의 리공션 솔루션을 추가합니다.
섭씨 37도에서 30분 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 배양합니다. 이전에 설명한 대로 슬라이드를 세척하고 건조한 후, 빛으로부터 보호되는 갓 준비된 증폭 용액 40마이크로리터를 각 14-14밀리미터 공간에 추가합니다. 습하고 어두운 챔버에서 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 40분 동안 배양합니다.
슬라이드를 1x 세척 버퍼 B50밀리리터로 각각 10분 동안 두 번 세척하고, 슬라이드의 50 밀리리터로 1분 동안 슬라이드를 세척하고, 슬라이드의 에폭시 코팅 둘레를 건조한 후, 각 샘플에 10 마이크로리터의 장착 미디엄을 추가하고, 중간 크기로 퍼질 수 있도록 10마이크로리터를 1분 동안 세척합니다. 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 페인트하여 커버슬립을 밀봉하고 미끄러질 수 있습니다. 커버슬립을 이동하지 마십시오.
매니큐어가 빛으로부터 보호되는 실온에서 적어도 20 분 동안 굳어지게하십시오. FLAG 및 GFP 항체와 세균의 면역 염색은 생식선에서 발현 패턴을 드러냈습니다. GFP는 생식선 전체에 걸쳐 표현되었지만, OMA-1:GFP 발현은 후기 파시텐과 난모세포로 제한되었다.
플래그 면역 염색은 3xFLAG:DLC-1이 두 균주에서 세균라인을 통해 발현되었다는 것을 보여줍니다. 세균선에서 PLA 정량화에 대한 관심 영역은 모든 세균의 난모세포를 통해 후기 파시테네를 포괄했다. 이것은 OMA-1 식의 영역입니다.
3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP 세균은 3xFLAG:DLC-1, GFP 생식선에 비해 이 지역 내에서 더 많은 양의 PLA 포시를 갖는 것으로 나타났다. 챔버의 습도를 높이기에 충분한 물이 있는지 확인하십시오. 또한 슬라이드가 챔버 내부의 수준인지 확인하여 시약의 유출을 방지합니다.
근접 결찰 분석에 따라 압출 된 생식선은 공초점 현미경으로 이미지화되고 피지, ImageJ 워크플로우를 사용하여 정량화 할 수 있습니다. 이 정량화는 상호 작용이 통계적으로 유의한지 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. PLA를 통해 선충 성 생식선 개발의 중요한 조절기관 간의 시상 상호 작용을 평가할 수 있었습니다.
