O ensaio de ligadura de proximidade permite que os usuários detectem interações proteína-proteína in situ, revelando padrões espaciais e temporais das interações. Esta técnica pode ajudar a responder a perguntas importantes sobre a regulação do desenvolvimento de C.elegans. Esta técnica oferece sensibilidade comparável para detecção de interações proteína-proteína sem a complexidade de outras técnicas, como FRET e BiFC.
Indivíduos que nunca dissecaram vermes para libertar as gônadas podem lutar com este passo. Pratique os vermes de dissecção e use-os para imunofluorescência para aperfeiçoar as técnicas de manuseio e dissecção antes de passar para o PLA. Para começar, escolha de 30 a 40 vermes adultos jovens em um prato de vidro de relógio contendo 500 microliters de 1x M9 e levamisole.
Depois de coletar os vermes, remova e descarte cuidadosamente a maioria dos meios de comunicação para remover bactérias que são transferidas junto com os vermes. Adicione 500 microliters frescos de 1x M9 e levamisole, e use a pipeta para elaborar suavemente e dispensar a mídia para enxaguar os vermes. Remova e descarte cuidadosamente a maioria dos meios de comunicação.
Repita a lavagem duas a três vezes. Após as lavagens, deixe os vermes em cerca de 100 microliters de mídia por não mais do que oito minutos. Usando uma pipeta de vidro ou polietileno, transfira os vermes para um slide de microscópio de 25 milímetros por 75 milímetros revestido com 001% de poli-L-lysine.
Remova o excesso de mídia para que aproximadamente 15 microliters de mídia permaneçam no slide. A remoção do excesso de buffer é fundamental para garantir que os vermes e gônadas dissecados aderam ao slide. Sob um microscópio dissecando, com duas agulhas calibre 26 1/2, coloque uma agulha sobre a outra para que as extremidades formem uma tesoura.
Usando as agulhas orientadas desta forma, corte os vermes atrás da faringe para liberar as germinas. Disseca todos os vermes em cinco minutos. Depois que todos os worms forem dissecados, coloque suavemente um deslizamento de cobertura de 22 milímetros por 40 milímetros sobre o slide para que ele seja perpendicular ao slide.
As extremidades do deslizamento devem pendurar fora do slide. Congele os slides em um bloco de alumínio pré-refrigerado mantido em gelo seco por pelo menos 20 minutos. Coloque suavemente um lápis refrigerado em cima da tampa para evitar que a mancha de cobertura fique solta devido à expansão do gelo.
Quando estiver pronto para fixação, retire as tampas com um lápis e mergulhe imediatamente o slide em um frasco contendo metanol fresco e gelado por um minuto. Em seguida, limpe suavemente as bordas do slide ao redor da amostra e aplique 150 microliters de formaldeído fixativo à temperatura ambiente para fixar por cinco minutos. Toque o slide em uma toalha de papel em um ângulo perpendicular de 90 graus para deixar o fixador sair do slide e absorver a toalha de papel.
Bloqueie os slides duas vezes durante 15 minutos em temperatura ambiente em um frasco de Coplin com 50 mililitros de PBT/BSA. Em seguida, bloqueie os slides com uma solução PBT/BSA contendo soro de cabra 10% normal. Limpe suavemente as bordas que circundam o slide e aplique 100 microliters da solução a cada slide.
E agitar suavemente o slide para ajudar a espalhar a solução. Incubar por uma hora em temperatura ambiente em uma câmara úmida. Coloque o slide em uma toalha de papel para deixar a solução escorrer e limpe suavemente as bordas.
Para bloquear os slides, aplique uma gota do reagente de bloqueio ao espaço de 14 milímetros por 14 milímetros. Incubar os slides por uma hora a 37 graus Celsius em uma câmara úmida. Coloque os slides em uma toalha de papel para deixar o reagente de bloqueio sair do slide e limpar suavemente as bordas.
Use o anticorpo diluído para diluir os anticorpos primários. Aplique 40 microliters da solução de anticorpos primários diluídos por espaço de 14 por 14 milímetros nos slides. Coloque os slides em uma câmara úmida e incubar durante a noite a quatro graus Celsius.
Pela manhã, lave os slides duas vezes por cinco minutos, cada um com 50 mililitros de 1x tampão de lavagem A à temperatura ambiente em um frasco de Coplin. Coloque o frasco de Coplin em um agitador orbital a 60 rpm. Coloque os slides em uma toalha de papel para deixar o tampão de lavagem sair do slide e limpar suavemente as bordas.
Prepare uma solução de 40 microliter contendo sondas mais e menos. Adicione a solução a cada espaço de 14 por 14 milímetros. Incubar os slides em uma câmara úmida por uma hora a 37 graus Celsius.
Lave os slides duas vezes por cinco minutos cada um com 50 mililitros de 1x tampão de lavagem A à temperatura ambiente em um frasco de Coplin. Coloque o frasco de Coplin em um agitador orbital a 60 rpm. Diluir o tampão de ligadura de um a cinco com água ultrapura.
Use este buffer para diluir o ligase de 1 a 40 para preparar um estoque de trabalho de solução de ligadura. Coloque o slide em uma toalha de papel para deixar o tampão de lavagem correr para fora dos lados e limpe suavemente as bordas. Adicione 40 microliters da solução de ligadura a cada espaço de 14 por 14 milímetros.
Incubar os slides em uma câmara úmida por 30 minutos a 37 graus Celsius. Depois de lavar e secar os slides como descrito anteriormente, adicione 40 microliters de solução de amplificação recém-preparada, protegida da luz, a cada espaço de 14 por 14 milímetros. Incubar os slides na câmara úmida e escura por uma hora e 40 minutos a 37 graus Celsius.
Lave os slides duas vezes por 10 minutos cada um com 50 mililitros de 1x tampão de lavagem B, e lave os slides uma vez por um minuto com 50 mililitros de tampão de lavagem de 01x B.Depois de secar o perímetro revestido de epóxi do slide, adicione 10 microliters de meio de montagem a cada amostra e coloque suavemente uma tampa de deslizamento na parte superior, permitindo que o meio de montagem se espalhe. Pinte ao redor da borda da tampa com esmalte para selar a mancha e deslizar. Evite mover a tampa.
Deixe o esmalte endurecer por pelo menos 20 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. A co-imunossuagem das germes com anticorpos FLAG e GFP revelou seu padrão de expressão na germinal. Enquanto a GFP foi expressa em toda a germina, a expressão OMA-1:GFP foi restrita ao paquiteno tardio e oócitos.
A imunostaining flag mostra que 3xFLAG:DLC-1 foi expresso em toda a linha germinal em ambas as cepas. A região de interesse para quantificação pla na germinal englobava o paquiteno tardio através dos oócitos em todas as germinas. Esta é a região da expressão OMA-1.
3xFLAG:DLC-1, Germes OMA-1:GFP pareciam ter uma maior quantidade de focos PLA dentro desta região em comparação com as germes 3xFLAG:DLC-1, GFP. Certifique-se de que há água suficiente para aumentar a umidade na câmara. Além disso, certifique-se de que os slides estão nivelados dentro da câmara para evitar o escoamento de reagentes.
Seguindo o ensaio de ligadura de proximidade, as gônadas extrudadas podem ser imagens em um microscópio confocal e quantificadas usando Fiji, ImageJ workflow. Essa quantificação pode ajudar a determinar se a interação é estatisticamente significante. O PLA nos permitiu avaliar interações in situ entre reguladores críticos do desenvolvimento de germinas nematoides.
