نحن نصف هنا بسيطة مفتوحة المصدر فيجي القائم على سير العمل المسمى دودة محاذاة، والتي يمكن استخدامها لتوليد المونتاج واحد أو متعدد القنوات من الديدان استقامة من الفائدة من الصور المجهرية الخام. لأن هذا العمل يعتمد على الحيوانات المختارة من قبل المستخدم من الفائدة ، قد يكون من المفيد بشكل خاص عند تحليل الصور من C.elegans حيث لا الديدان كلها في المرحلة الصحيحة أو الشرط. وتجدر الإشارة إلى أن الناتج من محاذاة الدودة يمكن استخدامها في التحديد الكمي اللاحق للفلوريس مع أي فيجي أو غيرها من برامج تحليل الصور.
هنا نبرهن على القياس الكمي الفلوري باستخدام خط أنابيب CellProfiler Worm_CP. ابدأ بإنشاء ميكروبيبت الفم عن طريق تمديد شعري زجاجي رفيع في شعلة شعلة بونسن. بعد التمديد في اللهب، وكسر الشعيرات الدموية إلى قطعتين إذا لم تقتحم إلى قطعتين بعد التمديد.
إذا كان كسر إلى قطعتين، وقطع نهاية أطول واحد. حدد أطول قطعة واختبار ما إذا كان الشعرية مفتوحة من خلال محاولة لpirate المياه. فصل المحول من أنبوب سيليكون ثلاثي المليمتر.
قم بتوصيل الشعيرات الدموية الزجاجية بمحول شعري مرتبط بأنبوب سيليكون من عيار 6 ملليمترات. ثم قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب الستة ملليمترات في مرشح ميكرومتر 0.2 وأنبوب سيليكون ثلاثي المليمتر على الطرف الآخر. قم بتوصيل طرف مرشح ملليمتر واحد في النهاية الحرة لأنبوب السيليكون ثلاثي المليمتر لتبخر السائل.
تحت مجهر تشريح، وإزالة أكبر قدر ممكن من السائل حول بيليه من الديدان الثابتة مع ميكروبيبت الفم. إضافة بسرعة 10 ميكرولترات من تصاعد المتوسطة إلى الجزء السفلي من الأنبوب. شطف طرف 10 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني مع آثار المنظفات لمنع الديدان من التمسك الجانبين من تلميح الماصات البلاستيكية.
ثم قطع نهاية الحافة مع زوج من مقص. نقل ثمانية ميكروليترات من المتوسطة المتصاعدة مع الديدان على وسادة agarose أعدت سابقا. أثناء مراقبة الشريحة تحت المجهر ، يهيج بلطف لتجنب تداخل الديدان.
ثم تغطية قطرة من المتوسط تصاعد على وسادة agarose مع 18 في 18 ملليمتر coverslip. لتركيب الديدان الحية، ماصة ثلاثة إلى أربعة ميكرولترات من ثلاثة ملليمتر levamisole حل في M9 على وسادة agarose. اختيار 30 إلى 50 الديدان في حالة في قطرة من levamisole.
ثم تغطية قطرة مع 18 في 18 ملليمتر يغطي وصورة الديدان في غضون ساعة واحدة. تثبيت حزمة برامج تحليل الصور مفتوحة المصدر فيجي من ImageJ، أو إذا كان مثبتًا بالفعل على الكمبيوتر، تحقق من أنه الإصدار 1.52A أو الإصدار الأحدث، ثم قم بتنزيل مستودع محاذاة الفيروس المتنقل من GitHub واحفظه على الكمبيوتر. بمجرد أن يتم تنزيل جميع مكونات خط الأنابيب وتثبيتها، افتح Fiji ونفذ الماكرو المتنقل بمحاذاة الفيروس بالنقر فوق المكونات الإضافية ووحدات الماكرو وتشغيلها في شريط القوائم الرئيسي.
حدد موقع محاذاة الفيروس المتنقل. ijm النصي وانقر على فتح. انتقل إلى مجلد الإدخال مع الصور التي سيتم تحليلها وانقر فوق حدد، مع التأكد من أن المجلد المحدد يحتوي على ملفات الصور فقط.
سيقوم الماكرو تلقائياً بإنشاء مجلد إخراج حيث سيتم حفظ كافة النتائج. سيكون اسم المجلد نفس مجلد الإدخال مع الإخراج كـ إصلاح ما بعد. السماح الماكرو لفتح الصورة الأولى في مجلد الإدخال واستخدامه كصورة تمثيلية لاستخراج الإعدادات المطلوبة لإنشاء المونتاج، بما في ذلك عرض الديدان، والسطوع، والتباين.
باستخدام أداة رسم الخط المستقيم، ارسم خطًا عبر عرض الفيروس المتنقل وانقر فوق موافق. استخدم طول هذا الخط لتحديد ارتفاع المناطق التي تم اقتصاصها للفيروسات المتنقلة المفردة. لكل قناة، حدد الاسم، جدول البحث، وما إذا كان يجب تضمينه في المونتاج، ثم انقر فوق موافق. بعد ذلك، اضبط إعدادات السطوع والتباين للقنوات باستخدام أشرطة التمرير. كرر هذه العملية للقنوات المتبقية.
بمجرد أن يتم تكوين كافة الإعدادات، سيتم تسجيلها في جدول إعدادات وحفظها في المجلد الفرعي CellProfiler من مجلد الإخراج. يتم إنشاء صورة لإظهار ما ستبدو عليه جميع الصور بعد تطبيق الإعدادات. إذا كانت الصورة مرضية، ضع علامة على المربع العلوي.
المربع الثاني والثالث من لوحة الاختيار جميع إعدادات تحديد الخيارات لتوليد المونتاج. اترك كلا المربعين علامة وانقر فوق موافق لتنفيذ بقية الماكرو. سيؤدي الفشل في وضع علامة على المربع العلوي إلى إعادة تشغيل الإعداد من قبل الماكرو.
الماكرو ثم ينتقل إلى فتح كافة الصور في مجلد الإدخال. لكل صورة، رسم خطوط على محور طولي من كافة الديدان ليتم تضمينها في المونتاج باستخدام مجزأة أو أداة خط حر. رسم خطوط باستمرار من الرأس إلى الذيل أو العكس بالعكس على طول كامل من الديدان وإضافة كل سطر إلى مدير ROI عن طريق النقر على التحكم T.Once تمت إضافة كافة الديدان المطلوبة، انقر فوق موافق. ثم سيقوم محاذاة الفيروس المتنقل بإنشاء صور مقصوصة من الديدان المحددة المفردة، والتي سيتم حفظها في المجلد الفرعي المتنقل الواحد لمجلد الإخراج.
سيتم حفظ المونتاجات من كافة الفيروسات المتنقلة المحددة في المجلد المحاذى. قم بتنزيل وتثبيت CellProfiler 2.2.0 بالنقر فوق الارتباط للإصدارات CellProfiler السابقة على صفحة التنزيل وتحديد نظام التشغيل المطلوب. قبل بدء تشغيل خط أنابيب Worm_CP تأكد من وجود كافة الصور الإخراج المتوقعة في المجلد الفرعي CellProfiler المجلد إخراج المتنقل محاذاة.
يجب أن تكون هناك نسخة مُعالجة من الصورة الأصلية، وقناع صورة ثنائية للسكان المتنقلين، وقناع محاذاة إذا كان الخط مرسومًا على دودة محددة وصورة واحدة تمثل كل قناة من القنوات في الصورة الأصلية. فتح CellProfiler، ثم انقر على وحدة إدخال الصور واسحب مجلد وحدة CellProfiler إلى النافذة التي تقول إسقاط الملفات والمجلدات هنا. إذا كانت قائمة الصور موجودة من تحليل سابق، قم أولاً بإزالة هذه الصور بالنقر بزر الماوس الأيمن في النافذة وتحديد قائمة ملفات واضحة.
انقر على وحدة إدخال بيانات التعريف وعلى أسلوب الاستخراج الثاني، انقر فوق المجلد الأصفر وانتقل إلى المجلد الفرعي CellProfiler المجلد إخراج المتنقل محاذاة. حدد ملف الإعدادات، ثم انقر على التحديث. بعد ذلك، انقر على أسماء وأنواع وحدة الإدخال، وتأكد من أن جميع الصور المطلوبة لخط الأنابيب موجودة.
قبل تشغيل خط الأنابيب، حدد وجهة لنتائج الإخراج في وحدة المخرجات. استخدم وضع الاختبار لمعرفة كيفية تنفيذ خط الأنابيب بالنقر فوق وضع اختبار البدء والسماح له بتشغيل الصورة الأولى في المجلد. عندما راض عن أداء خط الأنابيب، انقر فوق وضع اختبار الخروج وتحليل الصور.
قبل البدء في التحليل، تأكد من أن جميع العيون أمام وحدة التحليل مغلقة. عند اكتمال التحليل، افتح مجلد الإخراج Worm_CP الذي يتكون من ملفين CSV وDدان CSV وSdds CSV. زراعة وتصوير C.elegans وفقا للطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول تنتج صور كبيرة نظرة عامة من السكان دودة.
يعتمد إنتاج خط الأنابيب إلى حد كبير على جودة الخطوط المرسومة فوق الصور. تظهر هنا أمثلة السطر عدة والإخراج الخاصة بهم من محاذاة دودة. عند استخدام البرنامج النصي المتنقل، يمكن تحديد الهوية المرئية للدود المتقاطعة من صور التراكب الموجودة في المجلد الفرعي للبيانات، وكذلك من لوحات الديدان الفردية في المونتاج.
ويمكن أيضاً استخدام جدول مراقبة الجودة لتحديد الديدان المتداخلة. ومع ذلك، خطوط المتقاطعة هي مشكلة لخط Worm_CP. وذلك لأن Worm_CP يستخدم قناع الخط، وليس المناطق ذات الأهمية، للمساعدة في تحديد الديدان الفردية.
لذلك، سيتم تقسيم CellProfiler أحد من الفيروسات المتنقلة ككائنين. وقد استخدم خط أنابيب Worm_CP لقياس شدة الفلور من الحيوانات الثابتة التي تحمل صبغة فلورية تدمج في قطرات الدهون. وينخفض محتوى قطرات الدهون بنسبة 17٪ بين نوع البرية والحيوانات DBL1 متحولة باستخدام القياس الكمي اليدوي، و 12٪ باستخدام خط أنابيب Worm_CP.
Worm_CP أيضاً لقياس استجابة الصدمات الحرارية في الديدان الحية التي تعبر عن GFP تحت السيطرة على جين غير قابل للعلاج بالصدمة الحرارية. في غياب الإجهاد الحراري، لم تستحث الديدان تعبير GFP. عندما تتعرض الديدان كصدمة حرارة قصيرة، يتم حدوث تعبير GFP.
يعتمد إخراج Worm_CP إلى حد كبير على جودة الخطوط التي ترسمها باستخدام محاذاة Worm. تأكد من أن خطوطك لا تلمس أو تتداخل ورسم كل ما تبذلونه من خطوط في نفس الاتجاه. يمكن أن يساعدك فحص جدول مراقبة الجودة في تحديد الخطوط التي يتم لمسها أو تداخلها حتى تتمكن من استبعاد تلك الحالات من تحليلك.
ويمكن استخدام ناتج محاذاة الدودة في القياس الكمي اللاحق إما في فيجي أو في حزم برامج تحليل الصور الأخرى. لقد أظهرنا هنا خط أنابيب CellProfiler الأساسية للغاية التي يمكن دمج وحدات التحليل الأخرى بسهولة ، على سبيل المثال ، لحساب عدد قطرات الدهون أو لقياس شدة قطرات فردية داخل دودة. واحدة من ميزة هذه التقنية هي إمكانية قياس الفلورية من الديدان الفردية بسرعة.
في مختبرنا ، لدينا مصلحة في الجدوى الفردية باستخدام مراسلي الفلوريسنس ونستخدم دودة الانحياز Worm_CP بشكل روتيني لهذا الغرض.
