تزامن دروسوفيليا لتحديد أوقات circadian هو الخطوة الأولى في دراسة الأحداث التي إما السيطرة على أو الاستجابة إلى الساعة البيولوجية. التزامن من جميع النماذج سوف تتبع نفس النهج الأساسي. هناك العديد من الخطوات للقيام بذلك عمليا، وقد يبدو من الصعب وضعها جميعا معا.
نتوقع أن تحاول عدة مرات قبل أن يشعر الطبيعية. الحفاظ على درجات الحرارة مستقرة وأريد الضوء خلال الخطوات الثلاث دقائق. إعداد الطعام ذبابة في وعاء كروك في 121 درجة مئوية، وخلط كما تضاف المكونات.
تغطية الفخار وعاء وتقديم محتويات ليغلي المتداول، وخلط محتويات كل 10 دقائق. بعد 20 دقيقة في يغلي المتداول، إيقاف الحرارة، وإضافة 83.6 ملليلتر من الماء إلى وعاء كروك. اترك الغطاء خارجًا مع تبريد الطعام.
في حين أن الطعام هو التبريد، اثارة كل 10 دقائق لتجنب السماح للفيلم لتشكيل على القمة. أيضا قياس درجة الحرارة كل 10 دقيقة مع ميزان الحرارة الزجاج. بمجرد أن يبرد الطعام إلى أقل من 60 درجة مئوية، أضف حامض تيغوسبت والبروبيونيك، كما هو موضح في المخطوطة.
تخلط جيدا وضبط وعاء كروك للحفاظ على درجة الحرارة، فقط بضع درجات أقل من 60 درجة مئوية. استخدام مضخة ال peristaltic لتوزيع الطعام ذبابة. بالنسبة للقنينات الضيقة، قم بضخ 10 ملليلترات، ووزناً من أسفل ال أونصة ست، قم بضخ 60 ملليلتر.
تخزين الذباب من النوع البري في 25 درجة مئوية لمدة 10 إلى 12 يوما، حتى يتم إرفاق ما يقرب من 200 pupae إلى الدواخل من الزجاجة. لإزالة البالغين من الزجاجة، تلميح لهم في زجاجة جديدة، واستخدام نهاية مملة من فرشاة الطلاء رقم صفر لدفع أي بالغين المتبقية في. مسح فرشاة الطلاء مع 70٪ الإيثانول قبل وبعد الاستخدام.
احتضان الخادرة في 25 درجة مئوية للسماح للجيل القادم في الظهور. بعد ثلاثة أيام، سيكون عمر الذباب من صفر إلى ثلاثة أيام. تذكر أن درجة الحرارة والضوء وحتى اختيارك من الطعام سوف تؤثر entrainment.
تأكد من الاحتفاظ بها، كل عنصر تحكم أثناء التجربة. في النقاط الزمنية المعينة لجمع، واستخدام وسادة تخدير ثاني أكسيد الكربون لشل حركة الذباب، وجمع 100 من الذكور و 100 أنثى. الذباب الأنثوي أكبر بكثير من الذكور.
يمكن أيضا أن تكون تمايز الذباب عن طريق فحص الأعضاء التناسلية. الذكور لديهم عتمة تقريب الأعضاء التناسلية، في حين أن الإناث لديهم أخف وزنا، أكثر مدببة الأعضاء التناسلية. وضع الذكور والإناث في قارورة منفصلة مع 100 الإناث لكل قارورة و 50 الذكور لكل قارورة.
التفاعلات الاجتماعية الذكور تؤدي إلى العديد من الوفيات عندما يكون هناك 100 فرد في قارورة. لتمكين entrainment circadian أن يحدث، ووضع قارورة في حاضة نظم حاضة لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام. لإنتاج الذباب لentrainment في المستقبل، مكان 25 من الإناث المتبقية، وخمسة إلى سبعة من الذكور المتبقية في زجاجة جديدة.
احتضان الزجاجة في 25 درجة مئوية. لكل 100 ذباب سيتم جمعها. إعداد قارورة ضيقة بإضافة 4.8 ملليلتر من المثبت.
ضع القنينات الضيقة في دلو من الثلج، واصطح بالدلو والمناشف الورقية والرقائق والشريط إلى الحاضنة. لجمع الذباب، ضع قمعًا في القارورة الضيقة، ثم قم بإزالة الغطاء من قارورة الذباب وعكسه بسرعة في القمع. انقر بلطف للمساعدة في توجيه الذباب في قارورة المثبت.
عند جمع الذكور، والجمع بين قنينتين من 50 الذباب في قارورة واحدة ضيقة. التفاف قوارير لZT13 وZT19 في احباط. بعد نقل الذباب، الشريط القبعات في مكان لتجنب انسكاب.
ضع القنينات على خلاط Nutating عند 165 دورة في الدقيقة، وأربع درجات مئوية، لمدة أربع ساعات. الذباب لم تعد حساسة للضوء، لذلك، قد تتم إزالة احباط للتحقق من أن الذباب يجري غمرها في المثبت. بعد إزالة قارورة من خلاط Nutating، وإزالة الفورمالديهايد، ثم غسل الذباب ثلاث مرات مع 3000 ميكرولترات من 1X PBS، عكس القارورة خلال كل غسل.
تخزين قوارير في أربع درجات مئوية، في انتظار المناعة في المستقبل. تم استخدام الضوء والظلام لإشعال الذباب إلى الدورات circadian. تم التحقق من Entrainment عن طريق مناعة، وتحليل المناعةfluorescence من بروتين الفترة، علامة لentrainment circadian.
يُظهر التنقية المناعية لمقتطفات الخلايا الكاملة، التي أعدت من رؤوس الذباب المُثَنِي نمطًا أساسيًا من حركة البروتينات في الفترة وشدتها. يظهر الفلور المناعي للأدمغة المُدربة، التي تم جمعها في ZT1، بروتينات الفترة في نمط مميز. هذه الطريقة هي نقطة انطلاق لـ الفلوروس المناعي ، والمناعة ، والمناعة ، والتحليل السلوكي ، وأي تقنية أخرى قد ترغب في استخدامها لمقارنة كيفية تغير المسار مع مرور الساعة البيولوجية.
مع القدرة على entrain كائن حي النموذج الخاص بك، يمكنك أن تسأل إذا كان المسار المفضل لديك يتغير مع مرور الوقت، وما إذا كانت الآثار في المسار المفضل لديك يمكن أن يؤدي إلى تعطيل البيولوجية. وتتفاقم عدد من الأمراض عندما تتعطل الساعة البيولوجية. وسيساعدنا تحديد الآليات الأساسية على إيجاد أدوية أكثر فعالية للأشخاص الذين يعانون من أمراض، مثل الزهايمر ومرض باركنسون.
