والهدف من هذا البروتوكول هو تحديد الطريقة التي يمكن استخدامها لتحديد الجينات الجديدة التي تشارك في إشارات الكالسيوم. للقيام بذلك، ونحن نستخدم الشاشة الجينية الكلاسيكية إلى الأمام. إشارات الكالسيوم هو مسار استجابة دفاعية هامة في العديد من أنظمة النباتات.
من أجل تحديد الجينات المشاركة في هذا المسار ، استخدمنا الشاشة الجينية الكلاسيكية إلى الأمام. في هذه الطريقة، سيتم استخدام EMS كعامل الألكيلات لإدخال طفرات عشوائية في أنظمة النباتات. ويمكن بعد ذلك استخدام جيل المتحولين المتقدمين للفحص من أجل نمط ظاهري من الاهتمام.
بمجرد تحديد النمط الظاهري من الاهتمام، يمكن تعيين الجين السببية. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم نموذج نبات Arabidopsis التي لديها مراسل الكالسيوم ايكورين في طيفه. تزن 150 ملغ بذور من أيكورين لEMS الطفرات وأخرى 150 ملغ بذور لاستخدامها كتحكم.
نقل البذور إلى أنبوب فالكون 50 مل وإضافة 2٪ EMS أو الماء autoclaved. أثناء استخدام EMS، كن حذرا لأنه مسرطنة. وينبغي ارتداء التروس الواقية أثناء استخدام نظام الإدارة البيئية وينبغي منع أي نوع من الانسكابات.
ختم أنابيب فالكون مع البارافين والتفاف عليه رقائق الألومنيوم. تدوير نهاية الأنبوب على نهاية لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة. السماح للبذور لتسوية وإزالة حل EMS بعناية والتخلص في حاوية النفايات التي تحتوي على نفايات صوديوم صوديوم واحد.
اغسل البذور المُمَتَمَّعة جيداً بـ 40 مل من الماء المُقلَد الأوتوكامبوت ثماني مرات على الأقل. للغسل النهائي، إضافة 100 ملليمولار ثيوسلفات الصوديوم وشطف ثلاث مرات على الأقل لإزالة آثار EMS. نقع البذور في 40 مل من الماء autoclaved لمدة ساعة واحدة لنشر EMS من البذور ومن ثم وضعها على ورق Whatman حتى يجف تماما.
نقل البذور إلى Eppendorf واحتضان في أربع درجات مئوية لمدة يومين إلى أربعة أيام للتقسيم الطبقي. نقل كل من البذور المطفرة والبذور المعالجة بالماء إلى التربة ونقلها إلى غرف النمو مع فترة تصوير داكنة لمدة 16 ساعة وثماني ساعات عند 22 درجة مئوية ورطوبة نسبية بنسبة 70٪. من أجل تحديد ما إذا كان الطفرات الناجحة، والبحث عن قطاعات الكلورو.
لقد استخدمنا طريقة جمع البذور الأحادية المستندة إلى النسب ويتم إعطاء كل مصنع M1 رقمًا فريدًا. عند النضج، يتم حصاد البذور من هذه النباتات المتحولة الفردية وتخزينها كلخطوط M1 الفردية. يتم استخدام تعقيم البذور الإنتاجية العالية وبروتوكول جذر النبات المائية، وتكييفها من Ranf وآخرون.
في اليوم الأول، ضع ما يقرب من 12 إلى 15 M2 البذور لكل M1 سطر واحد في الآبار الفردية من لوحة ثقافة الأنسجة 24 جيدا وتعقيم باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك حل بنسبة ثلاثة إلى واحد. هذا يطلق غاز الكلور الذي يعقم البذور. اترك الطبق ليتبخر غاز الكلور المتبقي تمامًا.
بعد التعقيم، إضافة نصف قوة السائل MS وسائل الإعلام إلى الآبار الفردية وطبقة البذور لمدة يومين إلى أربعة أيام في أربع درجات مئوية، ومن ثم نقل البذور إلى غرفة النمو مع فترة الصورة من 10 ساعة ضوء و 14 ساعة الظلام في 22 درجة مئوية، 70٪ الرطوبة النسبية. في اليوم 14، مرة واحدة الشتلات هي ثمانية إلى 12 يوما من العمر، مكان 12 شتلات M2 من كل خط على حدة في لوحة مضيئة 96 جيدا. بعد نقل الشتلات، إضافة 150 ميكرولترات من خمسة محلول كولينترازين الدقيقة في الآبار الفردية وتخزينها في الظلام عند 21 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات.
Coelenterazine هي مجموعة اصطناعية التي ترتبط apoaequorin لتشكيل aequorin وظيفية. Coelenterazine هو ضوء حساس ومن ثم يتم تخزينها في زجاجات داكنة اللون محمية من الضوء. في اليوم التالي، المسوخ الشاشة باستخدام بيروكسيد الهيدروجين كحافز وقياس ارتفاع الكالسيوم اللاحقة.
وللت وقياس 24 بئرًا في وقت واحد، يتم إجراء برنامج حركي آلي، يتضمن قياس الخلفية لمدة دقيقة واحدة، يليه إضافة قياس تحفيزي لمدة 10 دقائق، يليه حقن التفريغ 150 ميكرولتر وقياس لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. وأي تصريف لابنة aequorin سيتم تضمينها في القراءة لتحديد كمية الكالسيوم المقاسة وكتحكم إضافي للـ aequorin الوظيفية. القراءات المقدمة من الطريقة المذكورة أعلاه في وحدات الضوء النسبي.
لحساب تركيز أيونات الكالسيوم السيتوسوليك، يتم استخدام معادلة تركيز سبق وصفها التي قدمها الإيجار و Knight في عام 2004، والتي تم وصفها في البروتوكول. تضاف وحدات الـ RLUs التي تم الحصول عليها من مقياس اللمعان إلى المعادلة لحساب تركيز أيونات الكالسيوم. ثم يتم رسم قيم أيونات الكالسيوم السيتوسوليك التي تم الحصول عليها رسومًا رسومية ضد عنصر تحكم من النوع البري لتحديد المسوخ البيروكسيد الهيدروجيني المفترضة إلى استجابة الكالسيوم.
وهذا نتيجة تمثيلية للبروتوكول المبين. لقد أظهرنا خط M1 واحد مع 12 شتلة فردية تم قياسها لارتفاع تركيز أيونات الكالسيوم. يشير الخط الأخضر في الرسم البياني إلى أيكورين من النوع البري الذي تم قياسه مع المسوخ.
الأحمر هو متوسط جميع الشتلات 12، والخط الأسود هو شتلات M2 الفردية تقاس لارتفاع أيون الكالسيوم. ثم يتم إنقاذ الشتلات التي تظهر استجابة مخفضة للغاية لتطبيق بيروكسيد الهيدروجين. ثم يتم إعادة تأكيد المسوخ التي تم إنقاذها في الجيل التالي، يليها رسم خرائط لتحديد الجينات السببية.
يجب توخي الحذر عند استخدام EMS كمتاجن لأنه مادة مسرطنة. وينبغي ارتداء العتاد الواقي في جميع الأوقات، وينبغي التعامل مع أي انسكاب يتم مع الممارسات المختبرية الجيدة. بالإضافة إلى ذلك، عند القيام بمجموعة من البذور على أساس النسب، ينبغي حصاد النباتات الفردية مع أقصى قدر من العناية بحيث لا يكون هناك خلط أي بذور في أي مرحلة.
وهذا سوف يساعد المرء على العودة وتتبع النبات الأم، وهو نبات متحولة homozygous. بالإضافة إلى ذلك، بما أن هذه الطريقة لا تدخل أي تحيز أو أي افتراضات سابقة في طريقة الفحص، يمكن استخدامها لشرط أو أكثر لتحديد نوع ظاهري من الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد جينات مستقلة متعددة باستخدام نفس البروتوكول.
البروتوكول سهل الاستخدام منذ مع جرعة صغيرة، يمكن أن يكون هناك عدد كبير من النباتات mutagenized. ويمكن استخدام هذا العدد الهائل من النباتات المتحولة لعدة مجموعات وعدد من الحالات ولتحديد عدة جينات. ويمكن تحديد فقدان جزئي للوظيفة، أو وظيفة معدلة، أو فقدان كامل للوظيفة، أو أيضا وظيفة جينية تأسيسية من خلال هذه الطريقة.
وينبغي أن يكون التخطيط مهمة سهلة بالنظر إلى التقدم في تكنولوجيات رسم الخرائط في السيناريوهات الحالية. ويمكن استخدام نظام رسم الخرائط القائم على نوفو، والتآمر العنصري القائم على SNP والعديد من الأنظمة الأخرى لتحديد الجين السببي الذي يسبب النمط الظاهري من الاهتمام. ونظرا لقابلية تطبيق هذه الطريقة، فإنه يمكن استخدامها ليس فقط على النباتات نموذج Arabidopsis، ولكن النباتات نموذج أخرى أيضا شريطة أن يمكن إنشاء النمط الظاهري من قراءات الفائدة.
