このプロトコルの目的は、カルシウムシグナル伝達に関与する新しい遺伝子を同定するために使用できる方法を同定することである。これを行うには、古典的な前方遺伝的画面を使用します。カルシウムシグナル伝達は、いくつかの植物システムにおける重要な防御応答経路である。
この経路に関与する遺伝子を同定するために、古典的な前方遺伝子スクリーンを用いた。この方法では、EMSをアルキル化剤として使用して、植物系にランダムな突然変異を導入するであろう。開発された変異体生成は、その後、関心のある表現型のスクリーニングに使用することができる。
目的の表現型が特定されると、因果遺伝子をマッピングすることができます。本研究では、カルシウムレポーターのエクオリンをスペクトルに含むモデル植物シロイヌナズナを用いた。EMS変異誘発のための150mgの種子を量り、別の150mgの種子をコントロールとして使用する。
50 mlファルコンチューブに種子を移し、2%EMSまたはオートクレーブ水を加えます。EMSを使用している間は発がん性があるので注意してください。EMSを使用している間は保護具を着用し、あらゆる種類のこぼれを防ぐべきである。
ファルコンチューブをパラフィンで密封し、アルミホイルを包みます。チューブの端を室温で18時間回転させます。種子が慎重にEMS溶液を落ち着いて取り除き、1つのモルNaOHを含む廃棄物容器に捨てます。
40mlのオートクレーブ水で変異原性種子を8回は十分に洗います。最後の洗浄のために、100ミリモルナトリウムチオ硫酸塩を加え、少なくとも3回リンスしてEMSの痕跡を取り除きます。40mlのオートクレーブ水に種子を浸して1時間浸し、種からEMSを拡散させ、完全に乾燥するまでWhatman紙に置きます。
種子をエペンドルフに移し、成層のために2〜4日間摂氏4度でインキュベートします。変異体化された種子と水処理された種子の両方を土壌に移し、摂氏22度と相対湿度70%で16時間の光と8時間の暗い写真期間を持つ成長室に移します。突然変異誘発が成功したかどうかを判断するために、クロロフィルのセーシングを探します。
我々は、単一の血統ベースの種子採取方法を使用しており、各M1植物は、一意の番号を与えられている。成熟すると、種子は、これらの個々の変異植物から収穫され、個々のM1ラインとして保存されます。高スループットの種子滅菌および水耕植物根プロトコルが使用され、Ranfらから適合される。
1日目には、M1当たり1ライン当たり12~15M2シード近くを24ウェル組織培養プレートの個々のウェルに配置し、次亜塩素酸ナトリウムと塩酸溶液を3個の割合で殺菌します。これは、種子を殺菌する塩素ガスを放出します。残りの塩素ガスを完全に蒸発させるために一晩プレートを残します。
滅菌後、個々の井戸に半強度の液体MS培地を加え、摂氏4度で2〜4日間種子を成層し、10時間の光と摂氏70%の相対湿度で14時間暗い写真期間の成長室に種子を移動させます。14日目には、苗木が8〜12日になったら、各ラインから12M2の苗を96ウェルのルミノメータープレートに個別に配置します。苗の移入後、個々の井戸に5マイクロモルコエレンタジン溶液の150マイクロリットルを加え、摂氏21度で8時間暗く保存します。
コエンテラジンは、機能的なエポリンを形成するためにアポエポリンに結合する補間基である。コエンテラジンは光に敏感であり、したがって、光から保護された暗い色のボトルに保存されています。翌日、過酸化水素を刺激として使用するスクリーン変異体を刺激し、その後のカルシウム上昇を測定する。
24個のウェルの同時測定では、1分間のバックグラウンド測定、刺激付加と10分間の測定、150マイクロリットルの吐出注入、3~5分間の測定を含む、アウト自動運動プログラムが行われます。そして、娘のエクオリンの排出は、測定されたカルシウムを定量化し、機能的なエクオリンの追加制御として読み取りに含まれるであろう。上記の方法から提供される測定値は、相対光単位です。
細胞体カルシウムイオン濃度を算出するために、2004年にレンタルとナイトによって与えられた先に記載された濃度方程式が使用され、これはプロトコルに記載されている。ルミノメーターから得られたRRLを式に加えてカルシウムイオン濃度を計算します。得られた細胞分解性カルシウムイオン値は、次いで、カルシウム応答に対する過酸化水素変異体を同定するための野生型制御に対してグラフィカルにプロットされる。
これは、表示されるプロトコルの代表的な結果です。カルシウムイオン濃度の上昇について測定された12個の苗を持つ1つのM1ラインを示しました。グラフの緑色の線は、変異体と共に測定された野生型のエクオリンを示しています。
赤は全12本の苗の平均で、黒い線はカルシウムイオンの標高に対して測定された個々のM2苗です。過酸化水素の適用に対する応答を非常に減少させた苗を救出する。その後、救出された突然変異体は次の世代で再確認され、続いて因果遺伝子を同定するためのマッピングが行われる。
それは発がん性物質であるため、ミュータゲンとしてEMSを使用する場合は注意が必要です。保護ギアは常に着用する必要があり、こぼれは良い実験室の慣行に対処する必要があります。さらに、種の血統ベースのコレクションを行うとき、個々の植物は、任意の段階で任意の種子の混合がないように細心の注意を払って収穫する必要があります。
これは、ホモ接合変異植物である母植物をさかのぼって追跡するのに役立ちます。さらに、この方法は、スクリーニング方法に偏りまたは任意の事前の仮定を導入しないので、1つまたは複数の条件に対して、目的の表現型を同定するために使用することができる。さらに、複数の独立した遺伝子を同じプロトコルを使用して同定することもできます。
プロトコルは、小さな投与量で、植物の膨大な数が変異型化することができるので、使いやすいです。突然変異植物のこれらの膨大な数は、いくつかの集団のために、いくつかの条件のために、いくつかの遺伝子を同定するために使用することができます。機能の部分的な損失、機能の変化、機能の完全な喪失、または構成的な遺伝子機能もこの方法によって同定することができる。
マッピングは、現在のシナリオにおけるマッピング 技術の進歩を考えると、簡単な作業であるはずです。デノボベースのマッピングシステム、SNPベースの人種プロットおよび他の多くは、関心のある表現型を引き起こす因果遺伝子を同定するために使用することができる。この方法の適用性を考えると、それはシロイヌナズナズモデルの植物だけでなく、興味のある読み出しの表現型を確立することができることを提供する他のモデル植物にも使用することができる。
