El objetivo de este protocolo es identificar un método que pueda utilizarse para identificar genes nuevos que intervienen en la señalización de calcio. Para ello, utilizamos la clásica pantalla genética directa. La señalización de calcio es una importante vía de respuesta de defensa en varios sistemas vegetales.
Con el fin de identificar los genes involucrados en esta vía, hemos utilizado la clásica pantalla genética hacia adelante. En este método, EMS se utilizaría como un agente alquilante para introducir mutaciones aleatorias en los sistemas vegetales. La generación mutante desarrollada se puede utilizar para detectar un fenotipo de interés.
Una vez identificado el fenotipo de interés, se puede mapear el gen causal. En este estudio, utilizamos la planta modelo Arabidopsis que tiene el reportero de calcio aequorin en su espectro. Pesar 150 mg de semillas de aequorin para la mutagénesis de EMS y otras semillas de 150 mg que se utilizarán como control.
Transfiera las semillas a un tubo Falcon de 50 ml y añada 2%EMS o agua autoclavada. Durante el uso de EMS, tenga cuidado porque es cancerígeno. Se deben usar engranajes de protección durante el uso de EMS y se debe prevenir cualquier tipo de derrame.
Selle los tubos Falcon con parafina y envuélvalo con papel de aluminio. Gire el extremo del tubo sobre el extremo durante 18 horas a temperatura ambiente. Deje que las semillas se asienten y retiren cuidadosamente la solución de EMS y deseche en un contenedor de residuos que contenga un NaOH molar.
Lavar bien las semillas mutagenizadas con 40 ml de agua autoclaveda al menos ocho veces. Para el lavado final, agregue 100 tiosulfato sódico mili evolucionado y enjuague al menos tres veces para eliminar restos de EMS. Remoje las semillas en 40 ml de agua autoclavada durante una hora para difundir EMS fuera de las semillas y luego colocarlas en papel Whatman hasta que estén completamente secas.
Transfiera las semillas a Eppendorf e incubar a cuatro grados Centígrados durante dos a cuatro días para la estratificación. Transfiera las semillas mutagenizadas y las semillas tratadas con agua al suelo y transfieralas a salas de crecimiento con 16 horas de luz y ocho horas de período de fotos oscuras a 22 grados centígrados y 70% de humedad relativa. Para determinar si la mutagénesis tuvo éxito, busque la sectoración de la clorofila.
Hemos utilizado el método de recolección de semillas a base de pedigrí único y a cada planta M1 se le da un número único. Tras la maduración, las semillas se cosechan de estas plantas mutantes individuales y se almacenan como líneas M1 individuales. Se utiliza una esterilización de semillas de alto rendimiento y un protocolo de raíz de planta hidropónica, adaptado de Ranf et al.
En el primer día, coloque casi 12 a 15 semillas M2 por M1 una línea en pozos individuales de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos y esterilice utilizando hipoclorito sódico y solución de ácido clorhídrico en una proporción de tres es a uno. Esto libera gas cloro que esteriliza las semillas. Deje la placa durante la noche para evaporar completamente el gas de cloro restante.
Después de la esterilización, agregue medios de MS líquidos de media fuerza a los pozos individuales y estratifique las semillas durante dos a cuatro días a cuatro grados centígrados, y luego mueva las semillas a una cámara de crecimiento con un período fotográfico de 10 horas de luz y 14 horas de oscuridad a 22 grados Celsius, 70% de humedad relativa. El día 14, una vez que las plántulas tienen de ocho a 12 días, coloque las plántulas de 12 M2 de cada línea individualmente en una placa de luminómetro de 96 pozos. Después de la transferencia de plántulas, agregue 150 microlitros de cinco micromolares de solución de Coelenterazine en pozos individuales y guárdelo en la oscuridad a 21 grados centígrados durante ocho horas.
Coelenterazine es un grupo protésico que se une a la apoaequrina para formar aequorin funcional. La coelenterazina es sensible a la luz y, por lo tanto, se almacena en botellas de color oscuro protegidas de la luz. Al día siguiente, los mutantes de la pantalla que usan peróxido de hidrógeno como estímulo y miden la elevación posterior del calcio.
Para la medición simultánea de 24 pozos, se realiza un programa cinético automatizado, que incluye la medición del fondo durante un minuto, seguido de la adición de estímulo y la medición durante 10 minutos, seguido de la inyección de descarga 150 microlitro y la medición durante tres a cinco minutos. Y cualquier descarga para la hija aequorin se incluiría en la lectura para cuantificar el calcio medido y como control adicional para la aequorin funcional. Las lecturas proporcionadas del método anterior se encuentran en unidades de luz relativa.
Para calcular la concentración citosólica de iones de calcio, se utiliza una ecuación de concentración previamente descrita dada por Rental y Knight en 2004, que se describe en el protocolo. Las RLU obtenidas a partir del luminómetro se añaden a la ecuación para calcular la concentración de iones de calcio. Los valores de iones de calcio citosólicos obtenidos se trazan gráficamente contra un control de tipo salvaje para identificar mutantes de peróxido de hidrógeno putativo en la respuesta al calcio.
Este es un resultado representativo del protocolo mostrado. Hemos mostrado una línea M1 con 12 plántulas individuales que se han medido para la elevación de la concentración de iones de calcio. La línea verde en el gráfico indica aequorin de tipo salvaje que se midió junto con mutantes.
El rojo es el promedio de todas las 12 plántulas, y la línea negra es plántulas M2 individuales medidas para la elevación de iones de calcio. Las plántulas que muestran una respuesta muy reducida a la aplicación de peróxido de hidrógeno son rescatadas. Los mutantes rescatados son reconfirmados en la próxima generación, seguidos de mapeo para identificar genes causales.
Se debe tener precaución al usar EMS como mutágeno ya que es un carcinógeno. El engranaje de protección debe usarse en todo momento y cualquier derrame realizado debe tratarse con buenas prácticas de laboratorio. Además, al hacer una recolección de semillas a base de pedigrí, las plantas individuales deben ser cosechadas con el máximo cuidado para que no haya mezcla de ninguna semilla en ninguna etapa.
Esto ayudará a uno a volver y rastrear la planta madre, que es la planta mutante homocigota. Además, dado que este método no introduce ningún sesgo ni ninguna suposición previa en el método de cribado, se puede utilizar para una o más condiciones para identificar un fenotipo de interés. Además, también se podrían identificar múltiples genes independientes utilizando el mismo protocolo.
El protocolo es fácil de usar ya que con la pequeña dosis, un gran número de plantas pueden ser mutagenizadas. Estos enormes números de plantas mutantes se pueden utilizar para varias poblaciones y para varias condiciones e identificar varios genes. Una pérdida parcial de la función, una función alterada, una pérdida completa de la función, o también la función genética constitutiva se puede identificar a través de este método.
La asignación debe ser una tarea fácil dado el avance en las tecnologías de mapeo en los escenarios actuales. Un sistema de mapeo basado en novo, una trama racial basada en SNP y muchos otros se pueden utilizar para identificar el gen causal que causa el fenotipo de interés. Dada la aplicabilidad de este método, se puede utilizar no sólo en las plantas modelo Arabidopsis, sino también en otras plantas modelo, siempre que se pueda establecer un fenotipo de lectura de interés.
