Le but de ce protocole est d’identifier une méthode qui peut être utilisée pour identifier les nouveaux gènes qui sont impliqués dans la signalisation du calcium. Pour ce faire, nous utilisons l’écran génétique avant classique. La signalisation de calcium est une voie importante de réponse de défense dans plusieurs systèmes végétaux.
Afin d’identifier les gènes impliqués dans cette voie, nous avons utilisé l’écran génétique avancé classique. Dans cette méthode, le SME serait utilisé comme agent alcalin pour introduire des mutations aléatoires dans les systèmes végétaux. La génération mutante développée peut alors être utilisée pour le criblage d’un phénotype d’intérêt.
Une fois que le phénotype d’intérêt a été identifié, le gène causal peut être cartographié. Dans cette étude, nous utilisons la plante modèle Arabidopsis qui a l’aequorin de journaliste de calcium dans son spectre. Pesez 150 mg de graines d’aequorine pour la mutagenèse ems et un autre 150 mg graines à utiliser comme contrôle.
Transférer les graines dans un tube Falcon de 50 ml et ajouter 2 % d’EMS ou d’eau autoclavée. Lors de l’utilisation du SME, soyez prudent parce qu’il est cancérigène. Les engrenages de protection doivent être portés pendant l’utilisation du SME et tout type de déversement doit être évité.
Sceller les tubes Falcon avec de la paraffine et l’envelopper de papier d’aluminium. Faire pivoter l’extrémité du tube au-dessus de l’extrémité pendant 18 heures à température ambiante. Laissez les graines s’installer et retirer soigneusement la solution EMS et jeter dans un récipient à déchets contenant une molaire NaOH.
Laver soigneusement les graines mutagenisées avec 40 ml d’eau autoclavée au moins huit fois. Pour le lavage final, ajouter le thiosulfate de sodium de 100 millimlaires et rincer au moins trois fois pour éliminer les traces de SME. Faire tremper les graines dans 40 ml d’eau autoclavée pendant une heure pour diffuser le SME hors des graines, puis les placer sur du papier Whatman jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches.
Transférer les graines à Eppendorf et incuber à quatre degrés Celsius pendant deux à quatre jours pour la stratification. Transférez les graines mutagenisées et les graines traitées à l’eau sur le sol et transférez-les dans des salles de croissance avec une période de photo sombre de 16 heures et huit heures à 22 degrés Celsius et une humidité relative de 70 %. Afin de déterminer si la mutagenèse a réussi, recherchez le secteur de chlorophylle.
Nous avons utilisé la méthode unique de collecte des semences à base de pedigree et chaque plante M1 reçoit un numéro unique. Lors de la maturation, les graines sont récoltées à partir de ces plantes mutantes individuelles et stockées sous forme de lignées M1 individuelles. Un protocole de stérilisation des graines à haut débit et de racine de plante hydroponique est utilisé, adapté de Ranf et coll.
Le premier jour, placez près de 12 à 15 graines M2 par M1 une ligne dans les puits individuels d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits et stérilisez à l’aide d’hypochlorite de sodium et d’acide chlorhydrique solution à un rapport de trois est à un. Cela libère du chlore gazeux qui stérilise les graines. Laissez la plaque pendant la nuit pour évaporer complètement le reste du chlore gazeux.
Après la stérilisation, ajouter des supports liquides de SP à demi-résistance aux puits individuels et stratifier les graines pendant deux à quatre jours à quatre degrés Celsius, puis déplacer les graines dans une chambre de croissance avec une période photo de 10 heures de lumière et 14 heures d’obscurité à 22 degrés Celsius, 70 % d’humidité relative. Le jour 14, une fois que les semis ont entre 8 et 12 jours, placez 12 semis M2 de chaque ligne individuellement dans une plaque de luminomètre de 96 puits. Après le transfert des semis, ajouter 150 microlitres de cinq micromolaires coelenterazine solution dans les puits individuels et stocker dans l’obscurité à 21 degrés Celsius pendant huit heures.
Coelenterazine est un groupe prothétique qui se lie à l’apoaéquorine pour former l’aequorin fonctionnel. La coelenterazine est sensible à la lumière et est donc stockée dans des bouteilles de couleur foncée protégées de la lumière. Le lendemain, dépister les mutants en utilisant le peroxyde d’hydrogène comme stimulus et mesurer l’élévation ultérieure du calcium.
Pour la mesure simultanée de 24 puits, un programme cinétique automatisé est mis en place, qui comprend la mesure de l’arrière-plan pendant une minute, suivie de l’ajout de stimulus et de la mesure pendant 10 minutes, suivie de l’injection de décharge 150 microlitres et de la mesure pendant trois à cinq minutes. Et n’importe quelle décharge pour l’aequorin de fille serait incluse dans la lecture pour quantifier le calcium mesuré et comme contrôle additionnel pour l’aequorin fonctionnel. Les lectures fournies à partir de la méthode ci-dessus se trouve dans des unités de lumière relative.
Pour calculer la concentration cytosolic d’ion de calcium, une équation de concentration précédemment décrite donnée par location et chevalier en 2004 est employée, qui est décrite dans le protocole. Les RLS obtenus à partir du luminomètre sont ajoutés à l’équation pour calculer la concentration d’ion de calcium. Les valeurs cytosoliques obtenues d’ion de calcium sont alors graphiquement tracées contre un contrôle sauvage-type pour identifier les mutants présumés de peroxyde d’hydrogène à la réponse de calcium.
Il s’agit d’un résultat représentatif du protocole indiqué. Nous avons montré une ligne M1 avec 12 semis individuels qui ont été mesurés pour l’élévation de la concentration d’ions calcium. La ligne verte dans le graphique indique l’aequorin sauvage qui a été mesuré avec des mutants.
Le rouge est la moyenne de tous les 12 semis, et la ligne noire est des semis M2 individuels mesurés pour l’élévation de l’ion calcique. Les semis présentant une réponse fortement réduite à l’application de peroxyde d’hydrogène sont ensuite sauvés. Les mutants sauvés sont ensuite reconfirmés dans la prochaine génération, suivis de la cartographie pour identifier les gènes causals.
Il faut faire preuve de prudence lorsqu’on utilise le SME comme mutagen puisqu’il est cancérigène. L’engrenage protecteur doit être porté en tout temps et tout déversement effectué doit être traité avec de bonnes pratiques de laboratoire. En outre, lors d’une collecte de graines à base de pedigree, les plantes individuelles doivent être récoltées avec le plus grand soin afin qu’il n’y ait pas de mélange de graines à n’importe quel stade.
Cela aidera à revenir en arrière et tracer la plante mère, qui est la plante mutante homozygote. De plus, comme cette méthode n’introduit aucun biais ou hypothèse préalable dans la méthode de dépistage, elle peut être utilisée pour une ou plusieurs conditions afin d’identifier un phénotype d’intérêt. En outre, plusieurs gènes indépendants pourraient également être identifiés en utilisant le même protocole.
Le protocole est facile à utiliser car avec le petit dosage, un grand nombre de plantes peuvent être mutagenized. Ces énormes plantes mutantes peuvent être utilisées pour plusieurs populations et pour plusieurs conditions et pour identifier plusieurs gènes. Une perte partielle de fonction, une fonction altérée, une perte complète de fonction, ou encore une fonction génétique constitutive peuvent être identifiés par cette méthode.
La cartographie devrait être une tâche facile compte tenu de l’avancement des technologies de cartographie dans les scénarios actuels. Un système de cartographie basé sur novo, un complot racial basé sur le SNP et bien d’autres peuvent être utilisés pour identifier le gène causal à l’origine du phénotype d’intérêt. Compte tenu de l’applicabilité de cette méthode, il peut être utilisé non seulement sur les plantes modèles Arabidopsis, mais d’autres plantes modèles aussi à condition qu’un phénotype de lecture d’intérêt peut être établi.
