ستوفر الطرق الموصوفة في هذا البروتوكول منصة قيمة لتقييم النضج الوظيفي ل ICMs لدراسات إعادة برمجة القلب. يتم مراقبة تدفق الكالسيوم حصريا في ICMs ويوفر طريقة لتقييم النضج الوظيفي ICM. هذه السلالة الماوس يبسط إجراءات التقييم ويعزز استنساخ النتائج.
هذا البروتوكول هو طريقة جديدة لتقييم النضج الوظيفي ICMs في مجال إعادة برمجة القلب. ويمكن أيضا أن تطبق لتقييم التمايز cardiomyocyte ووظيفة القلب. ابدأ بالحصول على ثمانية إلى عشرة جراء، جرو P0 إلى P2 لعزل 10 ملايين من الخلايا الليفية القلبية الوليدية، أو NCFs.
تخدير عميق للجراء عن طريق انخفاض حرارة الجسم. مراقبة قلوب تحت المجهر الفلوري لضمان أن القلب مع النمط الجيني المطلوب يظهر تدفق الكالسيوم، وأشار GCaMP3 مع قلوب ينبض. الأنماط الجينية الأخرى لن تظهر الفلورسينس.
بعد عزلة القلوب، قطعها إلى أربع قطع بحيث تكون متصلة بشكل فضفاض. غسلها جيدا عدة مرات في الجليد الباردة دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة، أو DPBS، في لوحة ستة سنتيمتر للحد من تلوث خلايا الدم في الخلايا المعزولة. هضم القلوب مع ثمانية ملليلتر من الحارة 0.25٪ تريبسين-EDTA في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
تجاهل التريبسين الفائق وإضافة خمسة ملليلتر من 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر نوع دافئ اثنين collagenase في محلول الملح المتوازن هانك. دوامة الخليط جيدا واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، مرة أخرى، دوامة الخليط جيدا والسماح للأنسجة غير المهضومة يستقر بالجاذبية.
جمع supernatant في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مع خمسة ملليلتر من المتوسطة الليفية الباردة. تمييع الخلايا مع متوسطة الخلايا الليفية بحيث كثافة البذر حوالي في 2-2.5 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مكعب. ثم بذر الخلايا في أطباق أو لوحات.
يجب أن يكون للخلايا الليفية المرفقة شكل بيضاوي إلى مستدير في اليوم الثاني بعد البذر. في اليوم صفر، بذور NCFs إلى كثافة حوالي 1-2 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مكعب في وسط الخلايا الليفية. في يوم واحدة يستبدل واحدة الثقافة وسط مع فيروس يحتوي وسط لكل جيدا بما أن يشد.
في اليوم الثاني، بعد 24 ساعة من الإصابة بالفيروس، استبدل الفيروس الذي يحتوي على وسيط بوسط ICM منتظم. تقييم تدفق أيونات الكالسيوم مع مجهر مضان مقلوب في درجة حرارة الغرفة. مراقبة الخلايا الإيجابية GCaMP3 تحت الهدف 10X، وضمان أنه يظهر الخلايا العفوية الضرب في قناة برايتفيلد.
وأظهرت قلوب مع النمط الجيني الصحيح تدفق أيون الكالسيوم متزامنة مع الضرب، تصور كما flourescence GCaMP3. في حين لم يلاحظ أي مضان في قلوب السيطرة. NCFs معزولة تعلق على البئر في غضون ساعتين وأظهرت شكل بيضاوي إلى مستدير بعد يوم واحد من البذر.
أظهر تذبذب أيون الكالسيوم تغيرا في الفلورية GCaMP3 بين الحد الأقصى والحد الأدنى وتغير تذبذب أيون الكالسيوم في مثل هذه الخلايا بشكل دوري. بعد إدخال IMAP ، كان عدد مجموعات الضرب أعلى بكثير من ذلك في المجموعة الخاضعة للرقابة حيث تم زيادة عدد الخلايا الإيجابية GCaMP3 مع تدفق أيونات الكالسيوم لحقل عالي الطاقة في المجموعة المعالجة المتوسطة IMAP. يجب أن تكون NCFs معدة حديثا وصحية بعد العزلة.
يمكن أن يساعد الإجراء السريع لعزل القلب والقطع ووقت الهضم المناسب على تجنب الحد من صلاحية الخلايا وحالتها. توفر هذه الطريقة طريقة لتحديد ICMs الناضجة وظيفيا للباحثين في إعادة برمجة القلب. مع العديد من أساليب التقييم الأخرى ، يمكن للمرء الحصول على فهم أكثر إيجازا حول ICMs الناضجة وظيفية.
