يستخدم هذا البروتوكول لدراسة تجميع وهيكل الأجزاء الأولية من الخلايا العصبية فرس النهر التي تفتقر إلى AIS تجميعها مسبقا بسبب عدم وجود ankyrin-G العملاقة. للبدء، تشريح ستة إلى ثمانية فرس النهر من مرحلة ما بعد الولادة، يوم واحد الجراء القديمة مع HBSS المتوسطة في طبق بيتري. فرم فرس النهر مع مقص تشريح إلى قطع أصغر، ونقلها من الطبق إلى أنبوب 15 ملليلتر.
غسل فرس النهر مرتين مع خمسة ملليلتر من HBSS، وتركها في 4.5 ملليلتر من HBSS بعد الغسيل. إضافة 0.5 ملليلتر من 2.5٪ تريبسين إلى 4.5 ملليلتر من HBSS، واحتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، عكس الأنبوب كل خمس دقائق. وينبغي أن تصبح فرس النهر هضمها جيدا لزجة وتشكيل مجموعة.
إذا لزم الأمر، تمديد الهضم لمدة خمس دقائق أخرى. غسل فرس النهر مع HBSS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل. بعد الغسيل، إضافة اثنين من ملليلتر من HBSS وماصة فرس النهر صعودا وهبوطا مع ماصة باستور 15 مرة.
تريتور الأنسجة مع ماصة باستور مصقول النار 10 مرات، وبقية الأنبوب لمدة خمس دقائق حتى جميع القطع تعيين إلى أسفل. كرر التريتوريشن مع القطع المتبقية حتى يختفي معظمها. ثم، استخدم طرف ماصة ملليلتر واحد لنقل الناتشرات الفائق الذي يحتوي على الخلايا العصبية المفككة برفق إلى أطباق الطلاء.
إضافته مباشرة إلى المتوسط الطلاء قبل احتضان ويهز لوحة بلطف. بعد ساعتين إلى أربع ساعات من البذر، تحقق من أطباق الطلاء بالمجهر الخفيف. غالبية الخلايا العصبية يجب أن تعلق على زلة الغطاء.
باستخدام ملقط طرف غرامة، والوجه الغطاء ينزلق إلى أطباق التغذية الخلية الدبقية التي تحتوي على المتوسطة ثقافة الخلايا العصبية مسبقا مع الجانب نقاط الشمع التي تواجه إلى أسفل. يمكن أن تنمو الخلايا العصبية في أطباق التغذية بالخلايا الدبقية لمدة تصل إلى شهر واحد. تغذية الخلايا العصبية كل سبعة أيام مع ملليلتر واحد من الخلايا العصبية الطازجة ثقافة المتوسطة.
في اليوم الثالث في المختبر، والوجه زلات الغطاء مع الجانب نقطة الشمع التي تواجه ما يصل الى طبق تغذية الخلايا الدبقية مع المتوسطة ثقافة الخلايا العصبية مشروطة. مزيج 0.25 ميكروغرام من الحمض النووي CRE BFP مع 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي أنكيرين-G GFP في أنبوب 1.7 ملليلتر لtransfect أربع زلات الغطاء. أضف 100 ميكرولتر الأمثل.
ثم خلط الأنبوب ويستريح على رف. إذا تم تحويل CRE BFP فقط ، يتم استخدام العمود الفقري البلازمي GFP لمطابقة الكمية الإجمالية للحمض النووي. امزج ثلاثة ميكرولترات من كاشف العدوى مع 100 ميكرولتر من الأمثل في أنبوب جديد 1.7 ملليلتر واحتضان الأنبوب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم، مزيج 100 ميكرولتر من الحمض النووي مختلطة سابقا مع 100 ميكرولتر من مزيج كاشف العدوى، وترك الأمر لمدة خمس إلى 10 دقائق على رف. أضف 50 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي فوق كل زلة غطاء عن طريق إدخال الطرف أسفل الوسط مباشرة دون لمس زلات الغطاء. ماصة ببطء لتجنب نشر مزيج الحمض النووي.
أحضر الطبق ببطء إلى الحاضنة واتركه هناك لمدة 30 إلى 45 دقيقة. الوجه الغطاء ينزلق مرة أخرى إلى طبق التغذية glial المنزل مع الجانب نقطة الشمع التي تواجه أسفل ووضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة. بالنسبة للقياس الكمي ل AIS، افتح صور السلسلة Z في فيجي وولد أقصى عرض للصور.
بعد طرح إشارة خلفية زلة الغطاء الفارغة من الصورة، ارسم خطا على طول AIS، مع التأكد من أن عرض الخط يغطي AIS بالكامل. بدء تشغيل الخط قبل رفع إشارة AIS فوق الخلفية وإيقاف بعد أن يسقط إلى الخلفية. قم بقياس متوسط كثافة البكسل على طول الخط، ثم قم بتصديره إلى جدول بيانات.
ثم قم بتشغيل برنامج نصي MATLAB لإنشاء الرقم النهائي. وينبغي أن تشمل التجربة Cre-BFP فقط transfection كتحكم سلبي، وكري BFP بالإضافة إلى 480 كيلودالتون أنكيرين-G cotransfection كتحكم إيجابي، وحالة غير مصابة كتحكم تقنية. في التحكم فقط في Cre-BFP ، تفتقر الخلايا العصبية المصابة إلى تراكم علامات AIS ، بما في ذلك ankyrin-G و Beta 4 spectrin و neurofascin وقنوات الصوديوم المسورة بالجهد.
في المقابل، قامت الخلايا العصبية المشتركة بين كري و480 كيلودالتون أنكيرين-جي بتجميع AIS بالكامل، وهو ما يتضح من وجود علامات AIS. من المهم التأكد من جودة الثقافة من خلال المقارنة مع الأطباق غير المصابة. الخلايا العصبية غير الصحية تميل إلى إظهار بنية AIS غير طبيعية، مثل AIS توقف أو خارج الرحم.
لتقييم كيفية تأثير طفرة اضطراب النمو العصبي البشري ankyrin-G على تجميع AIS ، تم رسم متوسط كثافة AIS من السمية إلى المحور البعيدة. تظهر البروتينات المخصبة AIS عادة زيادة سريعة في الإشارة من المحور القريب وانخفاض بطيء في الإشارة إلى المحور المحوري البعيدة. عندما تتماشى مع AIS غير المصابة، منحنى متحولة أوسع وذروة المنحنى هو أقل، مما يشير إلى تغيير هيكل AIS.
نوع البرية ankyrin-G تجميع AIS محاذاة بشكل وثيق مع واحد غير المصابة.
