Este protocolo é usado para estudar quantitativamente a montagem e estrutura dos segmentos iniciais de axônio de neurônios hipocampais que carecem de AIS pré-montada devido à ausência de um anquilo-G gigante. Para começar, dissecar seis a oito hipocampos do pós-natal, um dia filhotes de idade com meio HBSS em uma placa de Petri. Pique o hipocampi com uma tesoura de dissecção em pedaços menores, e transfira-os do prato para um tubo de 15 mililitros.
Lave o hipocampi duas vezes com cinco mililitros de HBSS, e deixe-os em 4,5 mililitros de HBSS após a lavagem. Adicione 0,5 mililitros de 2,5% de trippsina em 4,5 mililitros de HBSS, e incubar em um banho de água de 37 graus Celsius por 15 minutos, invertendo o tubo a cada cinco minutos. Hipocampi bem digerido deve ficar pegajoso e formar um aglomerado.
Se necessário, amplie a digestão por mais cinco minutos. Lave hipocampi com HBSS três vezes por cinco minutos por lavagem. Após a lavagem, adicione dois mililitros de HBSS e pipeta o hipocampi para cima e para baixo com uma pipeta Pasteur 15 vezes.
Triturar o tecido com uma pipeta Pasteur polida 10 vezes, e descanse o tubo por cinco minutos até que todos os pedaços se coloquem no fundo. Repita a trituração com os pedaços restantes até que a maioria deles tenha desaparecido. Em seguida, use uma ponta de pipeta de um mililitro para transferir suavemente o sobrenante contendo os neurônios dissociados para pratos de revestimento.
Adicione-o diretamente ao meio de chapeamento pré-incubado e agite a placa suavemente. Duas a quatro horas após a semeadura, verifique os pratos de revestimento com um microscópio leve. A maioria dos neurônios deveria ter ligado ao deslizamento da tampa.
Usando um fórceps de ponta fina, vire a tampa desliza para os pratos alimentadores de células gliais contendo meio de cultura neuronal pré-condicionado com os pontos de cera voltados para baixo. Os neurônios podem crescer nos pratos alimentadores de células gliais por até um mês. Alimentar neurônios a cada sete dias com um mililitro de meio de cultura neuronal fresca.
No terceiro dia in vitro, vire a tampa desliza com o lado do ponto de cera voltado para um prato alimentador de células gliais com meio de cultura neuronal condicionada. Misture 0,25 microgramas de DNA CRE BFP com 0,5 microgramas de DNA anquilo-GFP em um tubo de 1,7 mililitro para transfectar quatro deslizamentos de cobertura. Adicione 100 microliters ótimos.
Em seguida, misture o tubo e repouse em um rack. Se apenas o CRE BFP for transfeinado, a espinha dorsal plasmática GFP é usada para corresponder à quantidade total de DNA. Misture três microliters de reagente de transfecção com 100 microliters de ótimo em um novo tubo de 1,7 mililitro e incubar o tubo por cinco minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, misture 100 microliters do DNA anteriormente misturado com 100 microliters de mistura de reagente transfecção, e deixe-o por cinco a 10 minutos em um rack. Adicione 50 microliters da mistura de DNA em cima de cada deslizamento de cobertura, inserindo a ponta logo abaixo do meio sem tocar nos deslizamentos da tampa. Pipeta lentamente para evitar espalhar a mistura de DNA.
Leve lentamente o prato de volta para a incubadora e deixe-o lá por 30 a 45 minutos. Vire a tampa desliza de volta para o prato alimentador glial doméstico com o lado do ponto de cera voltado para baixo e coloque o prato de volta na incubadora. Para quantificação AIS, abra as imagens da série Z em Fiji e gere uma projeção máxima de imagens.
Depois de subtrair o sinal de fundo de deslizamento de tampa vazio da imagem, desenhe uma linha ao longo da AIS, certificando-se de que a largura da linha cubra totalmente o AIS. Inicie a linha antes que o sinal AIS seja levantado acima do plano de fundo e pare depois que ele cair para o fundo. Meça a intensidade média do pixel ao longo da linha e exporte-a para uma planilha.
Em seguida, execute um script MATLAB para gerar a figura final. O experimento deve incluir apenas a transfecção cre-bfp como controle negativo, Cre-BFP mais 480 kilodalton ankyrin-G cotransfection como controle positivo, e uma condição não transfectada como controle técnico. No controle somente do Cre-BFP, os neurônios transfectados não possuem o acúmulo de marcadores AIS, incluindo ankyrin-G, espectrina beta 4, neurofascina e canais de sódio fechados de tensão.
Em contraste, cre e 480 neurônios co-transfectados de 480 kilodalton ankyrin-G montaram totalmente AIS, o que é demonstrado pela presença de marcadores AIS. É importante confirmar a qualidade da cultura através da comparação com os pratos não transfectados. Neurônios insalubres tendem a apresentar estrutura AIS anormal, como AIS descontinuada ou ectópica.
Para avaliar como uma mutação da desordem neurodesenvolvimentista humana anquilina-G afeta a montagem da AIS, a intensidade média da AIS foi traçada da soma ao axônio distal. As proteínas enriquecidas pela AIS normalmente mostram um rápido aumento do sinal do axônio proximal e uma lenta diminuição do sinal para o axônio distal. Quando alinhada com a AIS não transfeinada, a curva mutante é mais larga e o pico da curva é menor, sugerindo uma mudança de estrutura da AIS.
O anquilo-G do tipo selvagem montou AIS intimamente alinhado com o não transfectado.
