이 프로토콜은 거대한 ankyrin-G의 부재로 인해 사전 조립 된 AIS가 부족한 해마 뉴런의 축삭 초기 세그먼트의 조립 및 구조를 정량적으로 연구하는 데 사용됩니다. 우선, 태아에서 6~8개의 해마를 해부하고, 어느 날 페트리 접시에 HBSS 배지를 가진 오래된 새끼를 해부한다. 해부 가위로 해마를 잘라서 접시에서 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오.
HBSS의 5 밀리리터로 해마를 두 번 씻고 세척 후 HBSS의 4.5 밀리리터로 둡니다. HBSS의 4.5 밀리리터에 2.5%의 트립신2.5%의 밀리리터를 넣고, 15분 동안 섭씨 37도의 수조에 배양하여 5분마다 튜브를 반전시릅니다. 잘 소화 된 해마는 끈적거리고 클러스터를 형성해야합니다.
필요한 경우 소화를 5분 더 연장합니다. HBSS로 해마를 세척당 5분간 3회 세척합니다. 세척 후, HBSS의 두 밀리리터와 파이펫해마를 파스퇴르 파이펫으로 15번 위아래로 넣습니다.
불을 연마한 파스퇴르 파이펫으로 조직을 10번 트리투레이하고 모든 덩어리가 바닥으로 바플 때까지 튜브를 5분간 쉬게 합니다. 나머지 청크로 트리튜레이션을 반복하면 대부분이 사라질 때까지 반복합니다. 그런 다음 1 밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 분리된 뉴런을 함유한 상체를 접시도금으로 부드럽게 전달합니다.
사전 인큐베이션 도금 매체에 직접 추가하고 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다. 파종 후 2~4시간 후에는 가벼운 현미경으로 도금 요리를 확인하십시오. 뉴런의 대부분은 커버 슬립에 부착해야합니다.
미세 한 팁 집게를 사용 하 여, 왁 스 점 측면 아래쪽으로 직면 하는 사전 조건된 신경 배양 매체를 포함 하는 신경 교 감 세포 공급 기 접시에 커버 슬립을 플립. 뉴런은 최대 한 달 동안 신경교 세포 피더 접시에서 성장할 수 있습니다. 신선한 신경 배양 배지의 1 밀리리터와 함께 7 일마다 뉴런을 공급합니다.
체외에서 셋째 날에는 왁스 도트 측이 조절된 신경 배양 배지가 있는 신경 세포 피더 접시에 올려다보며 커버 슬립을 뒤집습니다. CRE BFP DNA0.25 마이크로그램과 ankyrin-GFP DNA0.5 마이크로그램을 1.7 밀리리터 튜브에 혼합하여 4개의 커버 슬립을 변형시킵니다. 최적의 100마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 튜브를 섞고 랙에 놓습니다. CRE BFP만 전염되는 경우, GFP 플라스믹 백본은 총 DNA 양과 일치하도록 사용된다. 새로운 1.7 밀리리터 튜브에 최적의 100 마이크로리터와 트랜스페션 시약 3개의 마이크로리터를 혼합하고 실온에서 5분 동안 튜브를 배양합니다.
그런 다음 이전에 혼합된 DNA의 100마이크로리터를 100마이크로리터의 트랜스페션 시약 혼합물과 혼합하고 랙에 5~10분 동안 둡니다. 커버 슬립을 건드리지 않고 매질의 바로 아래에 팁을 삽입하여 각 커버 슬립 위에 DNA 믹스 50 마이크로리터를 추가합니다. 피펫은 DNA 혼합이 퍼지는 것을 피하기 위해 천천히.
천천히 접시를 인큐베이터로 가져와 서 30-45 분 동안 그대로 둡니다. 커버를 홈 글리아피더 접시에 다시 뒤집어 왁스 도트 쪽을 아래로 향하고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다. AIS 정량화의 경우 피지의 Z 시리즈 이미지를 열고 이미지의 최대 투영을 생성합니다.
이미지에서 빈 커버 슬립 배경 신호를 빼낸 후 AIS를 따라 선을 그려 줄너비가 AIS를 완전히 덮는지 확인합니다. AIS 신호가 배경 위로 올라오기 전에 선을 시작하고 배경으로 떨어뜨린 후 중지합니다. 선을 따라 평균 픽셀 강도를 측정하고 스프레드시트로 내보냅니다.
그런 다음 MATLAB 스크립트를 실행하여 최종 그림을 생성합니다. 실험에는 부정적인 대조체로 Cre-BFP만 트랜스페션, Cre-BFP 플러스 480킬로달톤 ankyrin-G 응아를 양성 제어로, 기술 제어로서 비감염 상태를 포함해야 한다. Cre-BFP 전용 제어에서, 전감염된 뉴런은 ankyrin-G, 베타 4 스펙트린, 신경파신 및 전압 문이 있는 나트륨 채널을 포함하여 AIS 마커의 축적이 부족합니다.
대조적으로, Cre 및 480 킬로달톤 ankyrin-G 공동 감염 된 뉴런은 AIS를 완전히 조립했으며, 이는 AIS 마커의 존재에 의해 입증된다. 비트랜스감염 된 요리와 비교하여 문화의 질을 확인하는 것이 중요합니다. 건강에 해로운 뉴런은 중단된 또는 자궁 AIS 같이 이상한 AIS 구조물을 보여주기 위하여 경향이 있습니다.
ankyrin-G 인간 신경 발달 장애 돌연변이가 AIS 어셈블리에 미치는 영향을 평가하기 위해, 평균 AIS 강도는 황산 축삭에 소마에서 플롯되었다. AIS 농축 단백질은 일반적으로 근위 축축에서 신호의 빠른 증가와 해축 축하에 신호의 느린 감소를 보여줍니다. 비트랜스감염된 AIS와 정렬하면 돌연변이 곡선이 넓고 곡선의 피크가 낮아 AIS의 구조 변화를 암시합니다.
야생형 앙키린-G는 AIS를 비트랜스감염된 것과 밀접하게 정렬하여 조립했다.
