Questo protocollo è usato per studiare quantitativamente l'assemblaggio e la struttura dei segmenti iniziali dell'assone dei neuroni ippocampali che mancano di AIS pre-assemblato a causa dell'assenza di un'anchirina-G gigante. Per iniziare, seziona da sei a otto ippocampi da cuccioli postnatali di un giorno con mezzo HBSS in una piastra di Petri. Tritare gli ippocampi con forbici di dissezione in pezzi più piccoli e trasferirli dal piatto a un tubo da 15 millilitri.
Lavare l'ippocampi due volte con cinque millilitri di HBSS e lasciarli in 4,5 millilitri di HBSS dopo il lavaggio. Aggiungere 0,5 millilitri di tripside al 2,5% in 4,5 millilitri di HBSS e incubare in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 15 minuti, invertendo il tubo ogni cinque minuti. Gli ippocampi ben digeriti dovrebbero diventare appiccicosi e formare un ammasso.
Se necessario, prolungare la digestione per altri cinque minuti. Lavare gli ippocampi con HBSS tre volte per cinque minuti per lavaggio. Dopo il lavaggio, aggiungere due millilitri di HBSS e pipettare l'ippocampi su e giù con una pipetta Pasteur 15 volte.
Triturare il tessuto con una pipetta Pasteur lucidata dal fuoco 10 volte e riposare il tubo per cinque minuti fino a quando tutti i pezzi non sono impostati sul fondo. Ripetere la triturazione con i blocchi rimanenti fino a quando la maggior parte di essi non è scomparsa. Quindi, utilizzare una punta di pipetta da un millilitro per trasferire delicatamente il supernatante contenente i neuroni dissociati a piatti di placcatura.
Aggiungerlo direttamente al mezzo di placcatura pre-incubato e agitare delicatamente la piastra. Da due a quattro ore dopo la semina, controllare i piatti di placcatura con un microscopio leggero. La maggior parte dei neuroni avrebbe dovuto attaccarsi allo scivolo di copertura.
Utilizzando una punta fine, capovolgere la copertura scivola sulle stoviglie di alimentazione delle cellule gliali contenenti un mezzo di coltura neuronale precondizione con il lato dei punti di cera rivolto verso il basso. I neuroni possono crescere nei piatti di alimentazione delle cellule gliali per un massimo di un mese. Nutrire i neuroni ogni sette giorni con un millilitro di mezzo di coltura neuronale fresco.
Il terzo giorno in vitro, capovolgere la copertura scivola con il lato del punto di cera rivolto verso l'alto in un piatto di alimentazione cellulare gliale con mezzo di coltura neuronale condizionato. Mescolare 0,25 microgrammi di DNA CRE BFP con 0,5 microgrammi di DNA GFP di anchirina-G in un tubo da 1,7 millilitri per trasfettare quattro scivolamenti di copertura. Aggiungere 100 microlitri ottimali.
Quindi mescolare il tubo e poggiato su un rack. Se viene transfettato solo CRE BFP, la spina dorsale plasmotica GFP viene utilizzata per corrispondere alla quantità totale di DNA. Mescolare tre microlitri di reagente di trasfezione con 100 microlitri di optimum in un nuovo tubo da 1,7 millilitri e incubare il tubo per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi, mescolare 100 microlitri del DNA precedentemente miscelato con 100 microlitri di mix di reagenti di trasfezione e lasciarlo per cinque-10 minuti su un rack. Aggiungere 50 microlitri della miscela di DNA sopra ogni slittamento di copertura inserendo la punta appena sotto il mezzo senza toccare i foglietti di copertura. Pipetta lentamente per evitare di diffondere il mix di DNA.
Riportare lentamente il piatto nell'incubatrice e lasciarlo lì per 30-45 minuti. Capovolgere la copertura scivola di nuovo verso il piatto di alimentazione gliale domestico con il lato a punti di cera rivolto verso il basso e rimettere il piatto nell'incubatrice. Per la quantificazione AIS, apri le immagini della serie Z nelle Fiji e genera una proiezione massima di immagini.
Dopo aver sottratto il segnale di sfondo dello slittamento di copertura vuoto dall'immagine, disegnare una linea lungo l'AIS, assicurandosi che la larghezza della linea copra completamente l'AIS. Avviare la linea prima che il segnale AIS sia sollevato sopra lo sfondo e fermarsi dopo che è uscita in background. Misurare l'intensità media dei pixel lungo la linea ed esportarla in un foglio di calcolo.
Quindi, eseguire uno script MATLAB per generare la figura finale. L'esperimento dovrebbe includere solo la trasfezione Cre-BFP come controllo negativo, Cre-BFP più 480 kilodalton anchirina-G cotrasfezione come controllo positivo, e una condizione non trasfettata come controllo della tecnica. Nel controllo solo Cre-BFP, i neuroni trasfetti mancano dell'accumulo di marcatori AIS, inclusi i canali di anchirina-G, beta 4 spectrin, neurofascina e sodio gated di tensione.
Al contrario, i neuroni co-trasfetati Cre e 480 kilodalton ankyrin-G hanno completamente assemblato l'AIS, che è dimostrato dalla presenza di marcatori AIS. È importante confermare la qualità della cultura rispetto ai piatti non trasfetti. I neuroni malsani tendono a mostrare una struttura AIS anomala, come l'AIS fuori produzione o ectopica.
Per valutare come una mutazione del disturbo del neurosviluppo umano anchirina-G influenzi l'assemblaggio AIS, l'intensità media dell'AIS è stata tracciata dal soma all'assone distale. Le proteine arricchite di AIS normalmente mostrano un rapido aumento del segnale dall'assone prossimale e una lenta diminuzione del segnale all'assone distale. Quando è allineata con l'AIS non trasfettato, la curva mutante è più ampia e il picco della curva è più basso, suggerendo un cambiamento di struttura dell'AIS.
Il tipo selvaggio ankyrin-G assemblato AIS strettamente allineato con quello non trasfetto.
