يقدم هذا البروتوكول سير عمل مرن متعدد المرونة PCR الذي يسمح بالعد الدقيق للكريات الكريات البيض التفاضلية استنادًا إلى علامات المثيلات اللاجينية. قد تسهل هذه المرونة ترجمة mdPCR نحو الاستخدام السريري. يوفر هذا الأسلوب النتائج التي الاستعلام عن كثب لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام أساليب التلطيخ المناعي.
على عكس التلطيخ المناعي، ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لا تتطلب عينات دم جديدة أو أجسام مضادة مكلفة. في التشخيص الدمي، يمكن أن تكون الكريات البيض التفاضلية بمثابة مؤشرات لطائفة من الأمراض، بما في ذلك العدوى والالتهاب وفقر الدم وسرطان الدم، ويجري النظر في ذلك كعلامة بيولوجية سرطانية مبكرة. ومن خلال عملية البرهان على هذا الإجراء مع عبد الرحمن إلمزالاوي، ستكون كريستينا ناصيف، المسؤولة الفنية من فريقنا في مركز أبحاث الأجهزة الطبية التابع للجنة.
تبدأ من قبل خلط دقيق 20 ميكرولترات من البروتين كيناز K و 400 ميكرولترات من عازلة الربط تحلل التي تحتوي على الخرز المغناطيسي مع ذوبان حديثا الخلايا أحادية النواة الدم الطرفية البشرية في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. بعد فترة حضانة مدتها خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل إزالة المابير. مع إزالة الأنبوب من المغناطيس ، وإعادة تعليق مجمع حبة الحمض النووي في 600 ميكرولترات من غسل العازلة واحدة لإزالة أي خرز غير ملزمة على وجه التحديد.
وضع أنبوب مرة أخرى على المغناطيس للسماح لإزالة من عظمى، قبل غسل الخلايا في 600 ميكرولترات من العازلة غسل اثنين كما هو موضح للتو. بعد إزالة supernatant، والسماح للأنبوب لتجف الهواء على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة قبل إضافة 100 ميكرولترات من عازلة elution إلى الأنبوب مع خلط شامل. ثم ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقة إلى دقيقتين لفصل الخرز المغناطيسي عن الحمض النووي الملمح، ونقل محلول الحمض النووي المنقى إلى أنبوب جديد.
لتحويل الـ(بيسولفيت) للحمض النووي المنقى، قم بنقل 20 ميكرولترات من عينة الحمض النووي الملمحة إلى أنبوب PCR، وإضافة 130 ميكرولترات من كاشف التحويل إلى الأنبوب. بعد خلط شامل، تدور لفترة وجيزة أسفل محتويات الأنبوب وتضخيم الحمض النووي على دورة حرارية. في نهاية الدورة، إضافة 600 ميكرولترات من العازلة ملزمة لعمود الكروماتوغرافيا أيون وضعت في أنبوب جمع، وإضافة الحمض النووي إلى العمود.
عكس أنبوب عدة مرات لخلط، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية في أقصى سرعة. تجاهل التدفق الذي تم جمعه من خلال، وإضافة 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت للغسيل إلى العمود. الطرد المركزي العمود وتجاهل تدفق من خلال مرة أخرى كما ثبت.
إضافة 200 ميكرولترات من عازلة إزالة الكبريت إلى العمود لاحتضان 15 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، قبل الطرد المركزي للعينة والتخلص من تدفق من خلال كما هو موضح. بعد ذلك، قم بغسل العمود مرتين بـ 200 ميكرولتر من عازل الغسيل في الغسيل. بعد الغسيل الثاني، قم بنقل العمود إلى أنبوب جمع جديد 1.5 ملليلتر، وإضافة 100 ميكرولترات من الماء الصف PCR إلى غشاء العمود.
ثم، elute الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي للعمود لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة. لتوليد قطرات، مزيج ميكرولتر واحد من الحمض النووي المحولة من البيسولفيت مع المزيج الرئيسي مسبار أعدت حديثا في أنبوب PCR، وجمع العينة مع الطرد المركزي وجيزة. استخدام تركيبات الذروة لتوصيل أنابيب سائلة يمكن التخلص منها إلى اثنين من الحقن الزجاجية الدقيقة 250 ميكرولتر الحجم.
وتعبئة ما قبل حقنة واحدة الزجاج الدقيق مع 250 ميكرولترات من النفط الناقل تحتوي على 5٪ flouro السطحي، وحقنة واحدة الزجاج الدقيق مع 50 ميكرولترات من زيت الناقل. عندما تم تحميل كل من الحقن، تحميل 100 ميكرولترات من مزيج PCR في حقنة من النفط الناقل، ووضع جهاز microfluidic قطرات على خشبة المسرح من المجهر الضوء تستقيم مجهزة كاميرا عالية السرعة. لمراقبة وتسجيل تكوين قطرات في الوقت الحقيقي، ضع المحاقن المعبأة مسبقا على مضخة حقنة قابلة للبرمجة، واستخدام الاتحاد الذروة مع التجهيزات لربط أنابيب الحقن إلى أنابيب قنوات مدخل كل منها من الجهاز microfluidic قطرات.
ضع الأنابيب من منفذ مولد القطرات إلى داخل أنبوب PCR 0.5 ملليلتر ، وضبط معدل تدفق مضخة الحقنة إلى اثنين من ميكرولترات في الدقيقة ، للسماح لحجم القطرات بالستقرار قبل جمع المستحلب الناتج. ببطء وبعناية جمع مستحلب من أعلى الأنبوب، ونقل 75 ميكرولترات من الحل إلى 200 ميكرولتر PCR أنبوب للدراجات الحرارية. ثم، تأكد من أن محتوى النفط في أنبوب PCR يطابق عن كثب حجم المرحلة المشتتة، لمنع اندماج القطرات أثناء الدراجات الحرارية، ووضع أنبوب 200 ميكرولتر في دورة حرارية.
بالنسبة للتصوير المفلور للعينة المستحلبة، قم بنقل مستحلب البوليستر إلى أنبوب شعري عميق يبلغ 50 ميكرومتر بوروسيليكات مع تشكيل جانبي مستطيل، للسماح بترتيب القطرات إلى طبقة أحادية معبأة قريبة للتصوير. بعد تحديد وختم الشعيرات الدموية على شريحة المجهر، تحميل الشريحة على خشبة المسرح من المجهر المقلوب. وفي برنامج التصوير المجهر، حدد الحصول على ويعيش بسرعة، لبدء اقتناء الكاميرا في الوقت الحقيقي.
ثم، مراقبة العينة تحت حقل مشرق والمجهر الفلوريسنس. بعد توليد القطرات وركوب الدراجات الحرارية، يمكن إدخال القطرات في الشعيرات الدموية الزجاجية بعرض ملليمتر واحد وارتفاع 50 ميكرومتر. للحصول على توزيع أحادي الطبقات من قطرات مثالية للحصول على صورة الفلوريسين، يمكن بعد ذلك تسجيل الصور لكل طول موجي.
بعد تحليل الصورة، يمكن رسم شدة الفلوريسنس لجميع قطرات في الفلوروفورات الخاصة بهم لتحديد عتبة قطرات إيجابية وسلبية. بعد تحديد الهوية والعد، يمكن حساب النسخ لكل قيم قطرات، ويمكن تحديد النسبة المئوية لـ CD3+T-cells، وC4+25+الخلايا التائية التنظيمية على أساس نسخ CD3Z و FOXP3 الميثيلتين على التوالي، فيما يتعلق بالنسخ لكل قطرة من الخلايا الكلية أو الجين C-less. ويمكن بعد ذلك مقارنة القيم في المئة لتلك التي تم الحصول عليها من خلال التصوير المناعي باستخدام الأجسام المضادة المناسبة.
أعتقد أن استقرار المستحلب من جيل القطرات من خلال الدراجات الحرارية وخطوات التصوير النهائية للقطر أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج دقيقة وموثوقة وقابلة للتكرار. يمكن استخدام تخصيص MD PCR من خلال تركيبة مزيج PCR مصممة خصيصًا لعدد من التطبيقات بما في ذلك أبحاث السرطان وتشخيص الأمراض المعدية والتحليلات على مستوى الخلية المفردة.
