Bu protokol, epigenetik metilasyon belirteçlerine dayalı hassas diferansiyel lökosit sayma sağlayan esnek bir multipleks damlacık PCR iş akışı sunar. Bu esneklik mdPCR'nin klinik kullanıma çevrilmesini kolaylaştırabilir. Bu yöntem, immünofloresan boyama yöntemleri ile elde edilenleri yakından sorgulayan sonuçlar sağlar.
Ancak immünofloresan boyamanın aksine, bu yöntem taze kan örnekleri veya pahalı antikorlar gerektirmez. Hematolojik tanıda, diferansiyel lökosit enfeksiyon, inflamasyon, anemi ve lösemi gibi hastalıkların bir spektrum için gösterge olarak hizmet verebilir, ve erken prognostik kanser biyomarker olarak kabul edilmektedir. Abdelrahman Elmanzalawy ile prosedürü gösteren Christina Nassif, NRC Tıbbi Cihaz Araştırma Merkezi'nde ekibimizden bir teknik subay olacaktır.
20 mikrolitre protein kiazı K ve 400 mikrolitre lysis bağlayıcı tampon içeren manyetik boncukları içeren 100 mikrolitre PBS'de taze çözülmüş insan periferik kan mononükleer hücreleri ile iyice karıştırarak başlayın. Oda sıcaklığında beş dakikalık bir kuluçka dan sonra, supernatant çıkarmadan önce bir ila iki dakika boyunca bir manyetik raf üzerine tüp yerleştirin. Tüp mıknatıstan çıkarıldığında, 600 mikrolitre yıkama tamponundaki DNA boncuk kompleksini yeniden askıya alarak özel olarak bağlı olmayan boncukları çıkarın.
Süpernatant kaldırılmasına izin vermek için mıknatıs üzerine tüp geri yerleştirin, yıkama tampon 600 mikrolitre içinde hücreleri yıkamadan önce iki sadece gösterildiği gibi. Supernatant çıkardıktan sonra, iyice karıştırma ile tüp elüsyon tampon 100 mikrolitre eklemeden önce bir dakika boyunca mıknatıs üzerinde hava-kuru tüp sağlar. Daha sonra, manyetik boncukları ima edilen DNA'dan ayırmak için tüpü manyetik rafa bir ila iki dakika yerleştirin ve saflaştırılmış DNA çözeltisini yeni bir tüpe aktarın.
Saflaştırılmış DNA'nın bisülfit dönüşümü için, ima edilen DNA örneğinin 20 mikrolitresini pcr tüpüne aktarın ve tüpe 130 mikrolitre dönüşüm reaktifi ekleyin. Iyice karıştırdıktan sonra, kısaca tüp içeriğini aşağı spin ve bir termal döngü üzerinde DNA yükseltmek. Döngünün sonunda, toplama tüpüne yerleştirilen iyon kromatografisi sütununa 600 mikrolitre bağlama tamponu ekleyin ve DNA'yı kolona ekleyin.
Tüpü karıştırmak için birkaç kez ters çevirin ve tam hızda 30 saniye santrifüj yapın. Toplanan akışı atın ve sütuna 100 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Sütunu santrifüj edin ve gösterildiği gibi akışı tekrar atın.
Örnek santrifüj ve gösterildiği gibi akış atmadan önce, oda sıcaklığında 15 ila 20 dakikalık bir kuluçka için sütuna 200 mikrolitre Desülfürasyon Tampon ekleyin. Daha sonra, yıkama başına yıkama tampon 200 mikrolitre ile iki kez sütun yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, sütunu yeni bir 1,5 mililitrelik toplama tüpüne aktarın ve sütunun zarına 100 mikrolitre PCR sınıfı su ekleyin.
Daha sonra, tam hızda bir dakika için sütun santrifüj tarafından DNA'yı eforuz. Damlacık üretimi için, bir mikrolitre bisülfit dönüştürülmüş DNA ile pcr tüpünde yeni hazırlanmış prob ana karışımını karıştırın ve numuneyi kısa bir santrifüjle toplayın. Tek kullanımlık akışkan boruları iki adet 250 mikrolitrelik hacimhassas cam şırıngasına bağlamak için tepe bağlantı parçaları kullanın.
Ve bir hassas cam şırıngasını %5 flouro yüzey aktif madde içeren 250 mikrolitre taşıyıcı yağ ve 50 mikrolitre taşıyıcı yağ içeren hassas cam şırıngaile önceden doldurun. Şırıngaların her ikisi de yüklendiğinde, 100 mikrolitre PCR karışımını taşıyıcı yağşın şırıngasına yükleyin ve yüksek hızlı kamerayla donatılmış dik ışık mikroskobunun aşamasına bir damlacık mikroakışkan cihaz yerleştirin. Damlacık oluşumunun gerçek zamanlı olarak gözlemi ve kaydı için, önceden doldurulmuş şırıngaları programlanabilir bir şırınga pompasına yerleştirin ve şırıngaların borularını damlacık mikroakışkan cihazın ilgili giriş kanallarının borularına bağlamak için bağlantı parçalarıyla pik birliğini kullanın.
Damlacık jeneratörünün çıkışından 0,5 mililitrelik PCR tüpün içine boru yerleştirin ve elde edilen emülsiyon toplamadan önce damlacık boyutunun stabilize olmasını sağlamak için şırınga pompası akış hızını dakikada iki mikrolitreye ayarlayın. Yavaş ve dikkatli bir şekilde tüpün üstünden emülsiyon toplamak ve termal bisiklet için 200 mikrolitre PCR tüp için çözeltinin 75 mikrolitre aktarın. Daha sonra, PCR tüpündeki yağ içeriğinin, termal bisiklet sırasında damlacıkların birleşmesini önlemek ve 200 mikrolitrelik tüpü termal döngüye yerleştirmek için dağılmış fazın hacmiyle yakından eşleştiğini onaylayın.
Emülsifiye numunenin floresan görüntülemesi için, pcr emülsiyonunu dikdörtgen profilli 50 mikrometre derinliğindeki borosilikat kapiller tüpe aktarın, böylece damlacıkların görüntüleme için yakın bir paketlenmiş tek katmanlı olarak düzenlenmesine izin verin. Kılcal damarları mikroskop slaytına sabitleyip mühürledikten sonra, slaytı ters mikroskop aşamasına yükleyin. Ve mikroskop görüntüleme yazılımı, seçin satın almak ve hızlı yaşamak, gerçek zamanlı kamera edinimi başlatmak için.
Daha sonra, parlak alan ve floresan mikroskopi altında örnek gözlemleyin. Damlacık üretimi ve termal bisiklet sonrasında, damlacıklar bir milimetre genişliği ve 50 mikrometre yüksekliği ile cam bir kılcal içine girişlenebilir. Floresan görüntü edinimi için ideal olan damlacıkların tek katmanlı dağılımını elde etmek için, görüntüler her dalga boyu için kaydedilebilir.
Görüntü analizinden sonra, kendi floresanlarındaki tüm damlacıkların floresan yoğunluğu, pozitif ve negatif damlacıkların eşiğini belirlemek için çizilebilir. Tanımlama ve sayımdan sonra, damlacık değerleri başına kopyalar hesaplanabilir ve CD3+T-hücrelerinin yüzdesi ve CD4+25+düzenleyici T-hücrelerinin yüzdesi, toplam hücre veya C-az genin damlacık başına kopyalarına göre sırasıyla metillenmiş CD3Z ve FOXP3 kopyalarına göre belirlenebilir. Yüzde değerleri daha sonra uygun antikorlar kullanılarak immünoresans görüntüleme yoluyla elde edilenlerle karşılaştırılabilir.
Ben termal bisiklet ve son damlacık görüntüleme adımları ile damlacık nesil emülsiyon istikrar hassas, güvenilir ve tekrarlanabilir nicelik selektif sonuçlar elde etmek için çok önemli olduğunu düşünüyorum. Özel PCR karışım formülasyonu ile MD PCR özelleştirme, tek hücre düzeyinde kanser araştırmaları, bulaşıcı hastalık teşhisi ve analitik gibi bir dizi uygulama için kullanılabilir.
